金銀花多倍體誘變及早期形態鑒定

王惠利，趙曉明

（1.運城農業職業技術學院，山西運城044000；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

金銀花別名二花、忍冬花，為忍冬科攀緣灌木植物[1]。其具有清熱解毒、涼風散熱功效[2]。金銀花為大宗名貴中藥材，主產于我國[3-6]，但目前以農家品種為多，人工培育的優良品種較少，且產量較低，生產不規范，質量差異較大，難以符合國際市場要求。而多倍體植株由于染色體的加倍，植株的細胞和器官表現出“巨型性”的顯著特征[7]，能增大植株的營養器官。藥用金銀花染色體加倍后，花巨型化，能較好地滿足生產要求。

本試驗采用改良L.D.Cua法對金銀花進行多倍體誘變育種研究，以期獲得多倍體金銀花新品種，增加中草藥的種質資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為忍冬科（Carprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera L.）二倍體金銀花（Lonicera japonica Thunb）。

1.2 試驗方法

1.2.1 二倍體金銀花多倍體的誘變

1.2.1.1 二倍體金銀花的播種 采用溫湯浸種法將二倍體金銀花種子浸種24 h后播于營養缽中（每個營養缽播10粒左右），覆2 cm厚的土。播種后每隔一段時間澆一次水，以保持營養缽充分濕潤，利于金銀花種子的正常萌發。

1.2.1.2 秋水仙素溶液的配制 （1）0.4%秋水仙堿母液的配制。將1 g秋水仙堿倒入棕色小口瓶中，先用少量95%的分析純酒精溶解，再加去離子水定容到250mL，然后放入冰箱4℃保存待用。（2）0.2%秋水仙堿溶膠＋1%瓊脂溶膠的配制。稱取0.2 g瓊脂，加去離子水10 mL，倒入60 mL燒杯中，標記刻度，加熱到瓊脂全部溶解為止，然后定容至刻度。待燒杯冷卻后加10 mL已配好的0.4%秋水仙堿母液，混勻，水密保存待用。（3）將0.2%秋水仙堿與1%瓊脂凝膠水浴加熱到37℃充分攪拌后即可用于誘變。

1.2.1.3 改良L.D.Cua法處理金銀花幼苗 營養缽中金銀花出土后，待其子葉展開、頂端分生組織剛剛開始萌動時，每天早晨用牙簽取少量0.2%秋水仙堿溶膠＋1%瓊脂溶膠滴于芽上，并充分包裹芽和子葉柄基部，分別處理24，48，72 h，誘變后蓋上透明塑料杯，處理結束后去營養缽，待秋水仙堿凝膠充分干燥時用尖鑷子撕去凝膠，停止誘變，以此來精確控制誘變時間。

1.2.2 M1變異植株的早期形態鑒定 在誘變處理后開始定期觀察、記錄幼苗生長發育狀況，并測量葉長、葉寬、株高、葉形等，觀察變異情況，并統計變異率。

1.2.2.1 M1變異株和對照株葉片形態的比較和測定 分別隨機選取M1變異株和對照株植株上相同部位的20片葉片作為樣本。每片葉選擇不同部位做切片5張，在顯微鏡下觀察，用顯微測微尺測量切口橫截面，得葉片的厚度，用直尺測量葉片的葉長和葉寬。用打孔測定法測定葉片面積。用葉片打孔器（1.5～2.0 cm）取下一定面積（A1）的葉片，將它與剩余部分的葉片分別烘干，求出打孔取樣的干葉質量（W1）和其余部分的干葉質量（W2），即可求出該葉片的面積（A）[8]。

1.2.2.2 M1變異株和對照株葉表皮顯微特征觀察與測定 在M1變異株和對照株植株中各隨機選擇10株，取每株相同部位的葉片為樣本，用尖嘴鑷子輕輕撕取葉片下表皮，置于潔凈的載玻片上，滴加一小滴1%的I-KI染液，靜置10 min后，在顯微鏡下觀察并用測微尺測量，測量時每個處理和對照隨機選取10個氣孔測量其長與寬；測得視野圓面積的直徑后計算出氣孔密度（氣孔數 /cm2）。

1.2.2.3 M1變異株和對照株葉片葉綠素含量及保衛細胞中葉綠體數的測定 用SPAD-502葉綠素儀測量對照株和變異株相同部位（第4片真葉）的相對葉綠素含量。保衛細胞中葉綠體數直接在顯微鏡下計數。

1.2.3 數據處理 數據采用SARS軟件進行統計，采用新復極差法進行差異顯著性分析[9]。

2 結果與分析

2.1 幼苗早期形態鑒定結果

按照公認的多倍體形態與二倍體形態的差異，多倍體的判斷標準為：（1）生長受阻；（2）葉色濃綠；（3）葉片皺縮；（4）植株畸形?？梢源俗鳛樽儺愔仓旰Y選的初步標準。

依據幼苗早期多倍體形態鑒定標準，用0.2%的秋水仙堿處理金銀花的幼苗頂芽時，處理時間為72 h的誘變效果最佳。處理24 h，誘變率達32.5%；處理48 h，誘變率達51.3%；處理72 h，誘變率達72.5%，且死亡率較低，誘變效果較好（表 1）。

表1 秋水仙素對金銀花幼苗的誘變效果

2.2 M1變異株和對照株形態學的比較

2.2.1 M1變異株和對照株葉片形態及葉形指數的比較 葉片皺縮、葉色濃綠、葉片大而厚且絨毛增多是M1變異株的一個顯著表現。用手觸摸可明顯感覺M1變異株的葉片較對照株的葉片增厚、柔軟。

從表2可以看出，M1變異株與對照株相比，葉色濃綠、葉片絨毛及葉柄絨毛變長。M1變異株比對照株葉片寬，且明顯增大，對照株葉片為長卵圓形，而M1變異株葉片為卵圓形，而且厚度增加。

表2 M1變異株與對照株葉部形態比較

從表3可以看出，M1變異株葉片的長寬都有所增加，厚度增加近1倍，葉面積增加，葉形指數變小。對變異株和對照株的葉面積進行顯著性測定，得到其在0.01水平上差異極顯著。M1變異株的葉部形態性狀有利于形成較大的光合作用面積，從而增加光合產物與干物質的積累，這是多倍體金銀花高產的形態生理基礎。

表3 M1變異株與對照株葉片大小比較及差異顯著性分析

2.2.2 M1變異株和對照株葉表皮特征比較 對M1變異株和對照株的葉表皮各項特征進行測驗，結果表明，M1變異株較對照株的氣孔增大，密度減小。采用新復極差法[9]，對變異株與對照株的氣孔直徑的變化進行顯著性測定，得到其在0.01水平上差異極顯著（表4）。

表4 M1變異株與對照株氣孔的比較

2.2.3 M1變異株和對照株葉片葉綠素含量及保衛細胞中葉綠體數的比較 對M1變異株和對照株葉片的葉綠素含量和保衛細胞中的葉綠體數進行測定，結果表明，M1變異株較對照株的葉片葉綠素含量增加，保衛細胞中的葉綠體數也增多。顯著性測定表明，變異株與對照株的葉綠素含量在0.01水平上差異極顯著（表5）。

表5 M1變異株與對照株葉綠素及葉綠體數的比較

3 討論與結論

3.1 秋水仙素處理的最佳時期

因為秋水仙素只作用于分裂中期細胞，因此，處理的苗期越小，則多倍體細胞與二倍體細胞比值就越大，誘變的成功率就越高。改良L.D.Cua法對金銀花進行多倍體誘變選擇在苗期，即子葉剛剛長出來的時期為最佳。

3.2 M1誘變成功植株早期形態特征的判定標準

3.2.1 生長受阻 由于秋水仙堿是一個重要的細胞毒物，會嚴重阻礙細胞正常的生理代謝。細胞為了消除這種毒害，不得不消耗大量的能量。因此，無論該細胞是否會加倍成多倍體，只要吸收了秋水仙堿就會發生生長受阻現象。但是，多倍體細胞由于核染色體加倍，其90%以上的DNA加倍，這種DNA的合成和染色體的增加是非常消耗能量的。因此，多倍體細胞的分裂速率顯著慢于二倍體細胞[10-11]。

3.2.2 葉色濃綠 金銀花加倍以后多倍體的葉綠體要比二倍體細胞增加1倍左右[12]。雖然葉綠體有自己獨立的DNA遺傳系統，但它的遺傳受到核基因的控制，所以當核染色體加倍后，由于染色體增加產生的基因劑量效應，會使葉綠體的數目增加。這樣就會造成多倍體較二倍體的葉色濃綠。

3.2.3 葉片皺縮 因為在一個相對短的誘變時間內，只有部分中期細胞會轉化為多倍體，其他細胞還是二倍體，這樣造成二倍體細胞和多倍體細胞的嵌合；又由于多倍體細胞與二倍體細胞生長速率與細胞體積不同，因此，2種細胞的后代細胞體積是不一樣的，就造成了葉片的皺縮。

3.2.4 植株畸形 在化學誘變中，由于秋水仙堿破壞了紡錘體的形成，造成了紡錘體的動物極和植物極的紊亂[13]。因此，在它的后代中會出現單極、三極和四極畸形現象。因此，我們在形態學上經?？吹蕉啾扼w植株當代發生葉片的扭曲、殘缺、頂端優勢喪失和改變；有性繁殖器官（花包括花萼、花瓣、子房和花藥）發生畸形，出現花粉的敗育、不受精現象、多花粉受精現象。在后代中，胚發育不正常；胚乳不發育；單子葉現象，三子葉現象，四子葉現象等等。

本試驗結果顯示，誘變后的多倍體金銀花植株在早期形態上與二倍體植株有明顯差異，所以，根據以上的判斷依據可以比較迅速而準確地辨別出多倍體。

[1]王琳，王寧夏.金銀花標準化種植技術[J].內蒙古農業科技，2011（6）：117-119.

[2]黃宣模，郭曉云，王祥福.金銀花種收質量的控制[J].內蒙古農業科技，2011（6）：129-130.

[3]王惠清.中藥材產銷[M].成都：四川科學技術出版社，2004：484-490.

[4]安德魯·薛瓦利埃.藥用植物百科全書[M].南寧：廣西科學技術出版社，2003：4.

[5]黃霞，樊駿，樊軍龍，等.金銀花的經濟價值與栽培技術[J].陜西林業科技，2004（4）：103-105.

[6]沈瑞.建造金銀花密植園六要點[J].天津農業科學，2006，12（4）：12.

[7]張興翠.花葉綠蘿的多倍體誘導及快速繁殖[J].西南農業大學學報，2004，26（1）：58-60.

[8]喬富廉.植物生理學試驗分析測定技術[M].北京：中國農業科學技術出版社，2002.

[9]蓋均鎰.試驗統計方法 [M].北京：中國農業出版社，2006：105-106.

[10]李政，黃靜潔，李凌.秋水仙堿誘變綠玉樹多倍體研究[J].西南大學學報，2007，29（2）：107-109.

[11]夏英武.作物誘變育種[M].北京：中國農業出版社，1997：92-93.

[12]戴思蘭.園林植物遺傳學 [M].北京：中國農業出版社，2005：100.

[13]王鴻鶴.秋水仙堿誘導重瓣大煙筒多倍體研究 [J].熱帶亞熱帶植物學報，1999，7（3）：237-242.