酶法提取黃酒糟蛋白工藝研究

左楠楠，王曉偉，金海如

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

黃酒糟是黃酒釀造工業的主要副產物，是發酵酒醪經壓榨、分離去酒液后留下的固形物，一般出糟率為20%～30%，我國有黃酒生產企業500多家，因此，黃酒糟的數量相當可觀[1-2]。黃酒糟的熱能比較低，含有不溶性物質多，難以直接利用，一般酒廠只對其進行簡單的粗加工后作為普通的飼料低價出售，或作為發酵飼料甚至任其白白爛掉，利用率很低[3]，造成其中蛋白質資源的極大浪費。

近年來，隨著世界人口增長和環境惡化的加劇，蛋白資源的缺乏已經成為人類共同面臨的嚴峻問題。對現有蛋白質資源，特別是對我國大量低值蛋白資源的精深加工，是解決長期以來嚴重制約我國食品工業發展問題的必要途徑[4-5]。植物蛋白具有較高的營養價值，是人們賴以生存的一類數量龐大的蛋白質資源[6]。蛋白質通過控制酶解技術可獲得一系列高附加值產品，蛋白酶能將蛋白質水解為肽和氨基酸，可以提高和改善蛋白質的溶解性、乳化性、起泡性、黏度、風味等，避免酸堿水解對氨基酸的破壞作用，保證蛋白質營養價值不受影響[7]。植物蛋白經水解后，分子量降低，結構疏松，便于人體酶的作用，吸收率大大提高[8]。目前，已有很多研究證明，水解蛋白具有很好的抗氧化性[9-11]。黃酒糟蛋白質含量豐富、質量較高，脂肪含量低且多為不飽和脂肪酸，可將其用于生產調味品、提取植物性蛋白和開發低脂高蛋白高纖維保健食品[12]。

本試驗研究黃酒糟蛋白的酶法提取工藝，旨在充分開發利用其中主要的水不溶性谷蛋白，可以極大地緩解我國蛋白資源匱乏的現狀，并可有效發展循環經濟，實現食品工業可持續發展。

1 材料和方法

1.1 材料

黃酒糟由浙江師范大學化學與生命科學學院微生物資源發掘與利用實驗室自制，粗蛋白含量26.73%（干基），粉碎后過0.149 mm篩待用；堿性蛋白酶由丹麥諾維信公司提供。

1.2 主要儀器與設備

試驗所用主要儀器與設備：LDHG-9053BS電熱鼓風干燥箱，離心機，FA1004萬分之一電子天平，SHA-2數顯恒溫振蕩器，PB-10型pH計，KDN-A凱氏定氮儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝條件 黃酒糟（3.00 g）→加水→調制適當pH值和溫度→酶解→滅酶（100℃，10 min）→離心（5 000 r/min，10 min）→收集上清液→測定其中氮含量。

1.3.2 總氮含量測定 總氮含量測定采用凱氏定氮法。

1.3.3 蛋白質提取率計算[13]水解蛋白提取率=水解液中蛋白質量/原料中蛋白質量×100%。

1.3.4 堿性蛋白酶提取的單因素試驗 以加酶量、pH值、溫度、時間及料液比作為單因素，研究各單因素對蛋白質提取率的影響。

1.3.5 堿性蛋白酶提取的正交試驗 根據單因素試驗，對加酶量、溫度、pH值、料液比4個因素，設計4因素3水平的L9（34）正交試驗，以蛋白質提取率為指標優化蛋白酶酶解的工藝。正交試驗設計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解反應各單因素對蛋白質提取率的影響

2.1.1 加酶量對蛋白質提取率的影響

從圖1可以看出，蛋白提取率隨加酶量的增加而增大，加酶量從0.5%增至1.5%時，蛋白提取率增長迅速；加酶量大于1.5%時，蛋白提取率增長緩慢。說明加酶量的增大提高了酶對酒糟中蛋白的作用能力，但當全部底物均與蛋白酶結合時再繼續增加酶量，單位時間內一部分酶不再與底物結合，酶解程度緩慢[14]，提取率就不再提高。

2.1.2 溫度對蛋白質提取率的影響 由圖2可知，在50～60℃時，酶的活性較低，蛋白質提取率增長較慢；高于60℃時，蛋白質提取率增長迅速；但高于65℃，由于酶變性，提取率反而下降。

2.1.3 pH值對蛋白質提取率的影響 由圖3可知，pH值小于8.5時，蛋白質提取率隨pH值的增大而上升；pH值在8.0～9.0的范圍內，蛋白質提取率較高，在此范圍內，堿性蛋白酶的活性較高，低于或高于此范圍，酶活力都會有所下降。pH值為8.5時，蛋白質的提取率達到最大值，這可能是由于該蛋白酶的最適反應pH值為8.5左右。

2.1.4 固液比對蛋白質提取率的影響

從圖4可以看出，在固液比低于1∶10時，隨著加液量的增加，蛋白提取率有較大的提高；在固液比為1∶10時，蛋白質提取率達到最大值，此后繼續加液，蛋白質提取率有所下降。原因是料液比過低時，反應體系較黏稠，難以攪拌混合，體系分散不均勻，酒糟不能很好地與蛋白酶結合，反應不能充分進行[15]；料液比過高時則降低了酶的相對濃度[16]，使其與底物碰撞的幾率大大降低，提取率有所下降。

2.1.5 反應時間對蛋白質提取率的影響 從圖5可以看出，在反應的前240 min，蛋白質的提取率隨著反應的進行而增大；適當延長提取時間，蛋白質分子充分溶脹，有利于蛋白質的溶出[17]；在240 min之后，蛋白提取率增長緩慢。隨著反應的進行，越來越多的蛋白質分解成氨基酸、多肽類物質，這些物質會對酶解反應有一定的抑制作用。因此，正交試驗中反應時間定為240 min。

2.2 正交試驗結果

試驗結果（圖6和表2，3）表明，在所選試驗因素數值范圍內，蛋白質提取率最高可達70.81%，其中，加酶量、溫度、料液比對蛋白質提取率影響均達顯著水平（P≤0.05）。

由單因素及正交試驗（表2）結果可得出，表觀最佳的因素水平組合為加酶量1.5%，pH值8.0，溫度65℃，料液比1∶10，該組合的蛋白提取率為70.81%。由極差分析得出的最佳因素水平組合為加酶量2.0%，溫度65℃，pH值8.5，固液比1∶10，在此條件下蛋白質的提取率為72.25%。因此，以極差分析所得組合作為優化水平設計，即堿性蛋白酶提取黃酒糟蛋白的優化工藝條件為加酶量2.0%，溫度65℃，pH值8.5，固液比1∶10，水解時間240 min。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗結果的方差分析

3 結論

本試驗結果表明，堿性蛋白酶提取黃酒糟蛋白的最佳因素水平組合為加酶量2.0%，溫度65 ℃，pH 8.5，固液比 1∶10，水解時間 240 min，在此條件下蛋白質的提取率為72.25%。

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