生物能源：一個不斷更新的老概念

袁 凌

（美國肯塔基大學植物與土壤系，Lexington，Kentucky40546）

生物能源是從生物材料中得到的可再生能源。今天“生物能源”是一個時髦的詞，我們常常把它和“新穎”或“高科技”等詞聯系起來。其實，人類很早以前就在使用生物能源了。古代中國人就已經用棉花籽油來點燈。生物能源作為工業已經有很長的歷史。在19世紀誕生的美國寶潔公司（Procter&Gamble）就是靠用棉花籽油來生產蠟燭和肥皂而起家的。更原始一點的生物能源就是燒木取暖，這與人類的歷史一樣久遠。生物能源之所以可以再生是因為生物，特別是植物和微生物，能夠把太陽能轉化成有機能源并儲存起來，隨著生物的再生，生物能源也就再生了。

生物能源怎么好像消失后又時髦起來了？原因是傳統的生物能源抵擋不住礦物能源的沖擊。20世紀初，電燈的出現把寶潔公司弄慘了，因為蠟燭不再是生活日用品。過去幾十年，石油和煤為主要能源，但是這些不能再生的能源現在開始面臨著斷源和環境污染等問題。今天的生物能源已不再用于燈油或蠟燭?？梢哉f，今天的生物能源可以取代石油和煤來生產大量人類需要的產品。因此，生物能源又時髦起來了。但是時髦與實用往往有差距。據美國能源部數據，目前生物能源（包括巴西蔗糖和美國淀粉糖生產的酒精）的生產成本比中東石油要高2～5倍。生物能源還面臨著產品單一性的問題。石油工業的成功不僅僅是因為它給了我們汽油和柴油，它還給了我們塑料、化肥和很多其他產品。我們今天穿的、吃的、住的和用的產品大多數是從石油來的。而甘蔗和淀粉只給了我們一個主要產品——酒精。因此，生物能源工業要有競爭性，就必須產品多樣化。

當今生物能源的研究和發展主要圍繞著降低成本和產品多樣化?，F在生物能源的生產不但成本高而且效率低。拿酒精生產作為一個例子，在美國一般每棵玉米只長一個玉米穗，也就幾百粒玉米。為了生產酒精，這些玉米粒會被用來提取淀粉，然后把淀粉分解成糖，再用糖去發酵來得到酒精。在這個過程中，整棵玉米的其他成分，比如玉米稈和葉子，都被扔掉了。在植物生長和光合作用過程中，大多數的能源是儲存在莖稈和葉里的（如纖維素和木質素），這一部分的能源在酒精生產中就被浪費了。即使在發酵過程中，每1個淀粉分解成的6碳糖中也只有4個碳可以合成酒精，另外2個碳變成二氧化碳釋放出來了，也就是說，1/3的碳被浪費掉了。蔗糖用于發酵也受到同樣的限制。這樣低的轉換效率對于任何工業都是不可想象的。說到酒精，它只是一種過渡性的生物燃料，早晚要被淘汰掉。酒精的弱點在于它的內燃能量低而且不能用管道輸送。淀粉酒精工業的另一個問題是它直接與糧食競爭，一定程度上引起了食品價格的提高。新一代的生物能源生產將包括降解和利用木質纖維素，并且能合成非酒精類的其他燃料或材料（比如塑料）。然而，要達到這些目標我們面臨著許多挑戰。這些挑戰跨越生物、化學、物理、工程、經濟和法律等多個學科。

天然的木質纖維素是很難降解的，從而保證了植物能在自然環境中獨立生存。目前，木質纖維素有效的降解方式包括使用酸堿溶液或高溫蒸汽，這些方法既帶來了污染也消耗了能源（用能源來生產能源，聽起來就不合理?。?，將來的解決方法很可能是用生物酶（一種催化反應的蛋白質）。淀粉降解工業就經歷過類似的改進。早期的淀粉降解也是使用化學和物理方法，今天已經改成用酶了，因為酶的效率高而且污染少。但是酶是一種大分子物質，這使它很難進入到木質纖維素里面去催化降解；另外，酶有很高的專一性，因此要降解成分復雜的木質纖維素就需要多種不同的酶。在應用上，降解木質纖維素需要多于10種不同的酶。而從工業角度看，使用多種酶就要增加生產成本。

1 新一代多功能酶可以減少降解酶的數量

如何減少用酶的數量，對我們搞蛋白工程的人是一種有趣的挑戰。國際上很多實驗室正在研究新的策略。我的肯塔基大學實驗室采用的手段是設計與合成多功能酶（multifunctional enzymes），也就是一個酶蛋白具有多種酶的功能。如果一個酶有3個酶的作用，那工業酶的數量就會減少到1/3，等于降低70%酶的成本。怎么去設計這樣的多功能酶呢？其實我們的設計原理存在于自然。不少的微生物可以合成多功能酶，一些多功能酶（比如cellulosomes）類似于子彈夾，可以把多顆子彈聯在一起；另一些多功能酶含有多個功能域（functional domains），好象一把瑞士軍刀（瑞士軍刀是一種最典型的多功能工具，它的刀把連著多種特殊的工具）。酶的功能域是酶蛋白中一種具有特殊功能的專一結構，它們的作用包括識別底物或催化反應。每個天然的蛋白都有一個或多個功能域，當我們把來自不同酶的功能域人工地結合起來，我們就創造了一種新的、類似于瑞士軍刀的多功能酶。當然，設計和合成這樣的酶并不是一個簡單的過程。在實驗室里，我們用多種基因克隆的手段，加上計算機模型的協助來合成一些新的基因，這些基因可以在微生物或植物細胞里表達并產生多功能酶蛋白。然后我們要分析這些新的酶，例如，與個體父本酶的混合劑比較，一個新的多功能酶是否有同樣的功能和活性。在蛋白工程中，我們經常面臨種種挑戰，比如，如何保證重組蛋白基因的表達，還有維持蛋白穩定性和活性等等。盡管如此，在過去幾年里，我們還是成功地合成了一些多功能酶（圖1）。這些人造酶含有高達5個功能域，并且都有很高的穩定性和活性[1-4]，能夠在細菌和植物里合成。直接把這些降解酶基因在植物細胞里表達，可以在分解木質纖維素的過程中減少甚至不用外加工業酶。這不僅可以減少降解酶基因的數目，還可以減少植物轉基因的難度。

2 天然酶不一定都能用于工業生產

不少天然的酶有良好的功能，但是它們還是不能被有效地應用于木質纖維素的糖化作用（saccharification）。這是因為在工業糖化過程中，產物（這里指的是單糖或多糖）的濃度會很高，而在酶催化作用中，高產物濃度往往會導致產物抑制（product inhibition）。也就是說，酶的產物會反過來抑制酶的活性。其后果是隨著糖化過程的進行和產物濃度的提高，酶的活性會迅速地降低，糖化作用也因此停止。近幾年，我的肯塔基大學實驗室和美國農業部的2個實驗室合作來解決產物抑制的問題，所采用的手段是蛋白定向進化（directed protein evolution）[5]。定向進化是利用自然進化的原理在實驗室里對1個基因或整個基因組進行快速的突變和選擇，進而得到符合目標的后代。我們對一個木糖苷酶（xylosidase）進行了改良；首先合成了大量的酶突變體，然后測定這些酶突變體在很高產物濃度中的活性，以選擇可以在很高產物濃度中還保持活性的突變體。在大約6 000個突變體中，我們篩選到了3個抗產物抑制的突變體，其中一個的抗抑制能力提高了3倍[6-7]。我們的工作證明了蛋白工程可以改良降解酶在工業過程中的效應。

3 誰說煙草公司的公子和石油集團的公主不能生個好小子？

在今天的社會里，“煙草”和“石油”2個詞總給人們一點反面和消極的感覺。想象一下煙草和石油聯姻會更令人擔心。但是，如果將來有一天我們生產的煙草不再導致煙霧騰騰，而能擠出汽油，“煙草”一詞聽起來就會香一點。我們能用煙草生產汽油嗎？2012年美國能源部給了由加州大學幾個實驗室和我的實驗室組成的一個團隊五百萬美金的資助來回答這個問題。我們首先看看石油是怎么來的，石油是由大量埋在地下的生物（主要是浮游低等動物和藻類）經過長期的高溫高壓而形成，這些低等生物中有一種能大量生產汽油主要成分的葡萄藻（Botryococcus）。近年來，一些控制葡萄藻油料合成的基因已被分離出來。葡萄藻盡管可以生產油類，但它本身的生長卻極其緩慢，不適合用于工業生產。我們的目標是把葡萄藻的油物合成代謝途徑轉移到植物里，這樣就可以利用植物的光合作用來生產汽油了。那我們再看看為什么要用煙草？煙草的主要成分是葉片，它的葉表面積比其他作物要大，光合作用的能力也較強。另外，用煙草生產能源不會與食物生產直接競爭。煙草的新用途將使這個有害的農作物變成有益的經濟作物。但是，單單把葡萄藻的油類合成途徑搬到煙草還不夠，我們的目標還要轉移大量的光合作用合成的碳氫化合物到油料生產上。我們計劃用基因工程來達到這個目標，同時還要提高植物光合作用的效率，相信能夠把煙草改變成一種新的能源作物。

這里我以自己的研究工作為例來介紹生物能源研究的一些動向。今天世界上還有許多非常優秀的科學家在為生物能源進行出色的研究工作。一些新的方向包括：（1）一步合成（consolidated bio-processing）。把木質纖維素降解和生產能源的發酵過程合二為一，以降低生產的成本和時間。（2）跨界轉移。把植物界或動物界的代謝途徑轉移到微生物，反之亦然，因而建立獨特和高效的生產平臺。（3）繼續發現和合成新的高能化合物。（4）加快對生物氫氣合成、收集和儲存的研究。（5）第2代生物能源工業化。如果把淀粉或蔗糖生產的酒精稱為第1代生物能源，一些以上提及的第2代生物能源已經到了建立試驗性工廠的發展階段。（6）探索法律及管理問題?？蒲泻图夹g的發展是飛速的，相比之下法律和管理往往顯得很被動。

生物能源已經不再是基礎科學研究，它是人類生存和社會持續發展的一部分，也創造了投資和就業的機會。

[1]Fan Z，Wagschal K，Chen W，et al.Multimeric hemicellulases facilitate biomass conversion[J].Appl Environ Microbiol，2009，75：1754-1757.

[2]Fan Z，Wagschal K，Lee CC，et al.The construction and characterization oftwoxylan-degradingchimeric enzymes[J].Biotechnol Bioeng，2009，102：684-692.

[3]Fan Z，Werkman J R，Yuan L.Engineering of a multifunctional hemicellulase[J].Biotechnol Lett，2009，31：751-757.

[4]Fan Z，Yuan L.Production of multifunctional chimaeric enzymes in plants:a promisingapproach for degradingplant cell wall from within[J].Plant Biotechnol，2010，8：308-315.

[5]Yuan L，Kurek I，English J，et al.Laboratory-directed protein evolution[J].Microbiol Mol Biol Rev，2005，69：373-392.

[6]Fan Z，Yuan L，Jordan D B，et al.Engineering lower inhibitor affinities in beta-D-xylosidase[J].Appl Microbiol Biotechnol，2010，86：1099-1113.

[7]Jordan D B，Wagschal K，Fan Z，et al.Engineering lower inhibitor affinities in beta-D-xylosidase of Selenomonas ruminantiumbysite-directed mutagenesis ofTrp145[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2011，38：1821-1835.