基于線粒體D-loop基因探討花鰻鱺的群體遺傳多樣性及其種群進化歷史

丁 旭, 齊 鑫, 尹紹武

(1. 海南大學 海洋學院, 海南 ?？?570228; 2. 南京師范大學 生命科學學院, 江蘇 南京 210046)

基于線粒體D-loop基因探討花鰻鱺的群體遺傳多樣性及其種群進化歷史

丁 旭1, 齊 鑫1, 尹紹武2

(1. 海南大學 海洋學院, 海南 ?？?570228; 2. 南京師范大學 生命科學學院, 江蘇 南京 210046)

通過測定花鰻鱺(Anguillia marmorata)海南群體(HN)和菲律賓群體(PH)共 19尾個體的線粒體D-loop基因的核苷酸序列(約1017 bp), 分析了花鰻鱺的種群遺傳結構。結果表明： A、T、G、C 4種核苷酸的平均含量分別為39.8%、28.3%、12.4%、19.4%, A+T含量(68.1%)明顯高于G+C含量(31.8%)。所測序列中存在73個變異位點, 共有18個單倍型。其中海南群體的單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多態性(Pi)、平均核苷酸差異數(k)分別為0.982、0.21577和219.655, 而菲律賓群體的單倍型多樣度、核苷酸多態性、平均核苷酸差異數分別為 1.000、0.26728和 271.821, 兩個群體之間平均遺傳距離(P)為0.3203。結果表明 2個群體遺傳變異較大, 菲律賓群體的遺傳多樣性較海南群體更加豐富。通過構建NJ分子系統樹表明2個群體的親緣關系較近。利用中性檢驗Tajima’s D (海南群體D=1.35345, P＞0.01;菲律賓群體D=0.79220, P＞0.01)和Fs(海南群體Fs=3.759; 菲律賓群體Fs=2.231)探討其種群歷史, 表明花鰻鱺群體進化過程種群數量較為穩定。

花鰻鱺(Anguillia marmorata); 海南和菲律賓群體; 線粒體D-loop基因; 遺傳多樣性; 種群進化歷史

鰻鱺(Anguillia)屬魚類(日本鰻(Anguillia japonica)、歐洲鰻(A. Anguillia)、美洲鰻(A. rostrata)等)具有特殊的生活史——在海水中產卵, 在淡水中生長。鰻鱺的產卵場遠離海岸線數千公里, 受精卵發育成柳葉鰻隨洋流游至河口, 在淡水中生長并發育至性成熟, 再洄游至海洋的產卵場繁衍后代[1]。在進化背景下, 海洋中多數魚類種群可視為隨機交配群體[2-3]。鰻鱺廣泛分布于溫帶到熱帶區域, 種群之間仍存在隨機交配[4]。但是, 花鰻鱺(A. marmorata)種群卻具有特殊的種群結構和生活史[5]?；狑~在分類學中屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鰻鱺目(Anguilliformes)、鰻鱺科(Anguillidae)、鰻鱺屬(Anguillia), 是一種廣泛分布于西印度洋-南、北太平洋的熱帶和亞熱帶區域的典型鰻魚。

關于鰻鱺種群結構的研究已有報道, Maes等[6]通過微衛星分析的方法發現歐洲鰻、美洲鰻、日本鰻和花鰻鱺具有高度的保守性。本實驗室通過研究線粒體細胞色素 b, 認為花鰻鱺與日本鰻鱺較為相似, 親緣關系較近, 且比歐洲鰻的進化程度更高;并認為花鰻鱺的夏威夷群體與日本群體間的地理差異較小, 但與海南群體的地理差異較大[7]。通過分析微衛星位點, 花鰻鱺的中國群體與澳洲群體具有較高的多樣性指數[8]。Ishikawa[9]從遺傳學角度把 花鰻鱺種群分為北太平洋、南太平洋和印度洋3個亞群, 其分布與現代海洋的洋流系統和水體結構相一致。在這些種群中僅僅發現了一個產卵場——位于北太平洋西部(菲律賓南部、斯里蘭卡東部、巴布亞新幾內亞和關島西部之間)的深海海溝中[10-11]。Aoyama等[12-13]發現花鰻鱺比溫帶鰻鱺的產卵周期更長、生長速度更快、洄游路徑更短。這表明花鰻鱺的種群結構比溫帶鰻鱺更加多樣。因此,研究花鰻鱺獨特的生理特點和種群結構, 能夠完善花鰻鱺基因型多樣性的證據, 為研究鰻鱺的起源、探索其產卵場位置、研究其洄游的生態學機制奠定基礎。

基因存儲了生物在進化過程中重要的遺傳信息。而線粒體基因(mtDNA)是母系遺傳, 其結構簡單、進化速度快, 是研究種間和種內遺傳多樣性的重要的分子標記[14]。D-loop是線粒體DNA主要的非編碼區, 它位于轉運脯氨酸和苯丙氨酸的tRNA序列之間。由于受選擇壓力小, D-loop區片段在進化過程中積累了較多變異, 且比其他線粒體控制區進化的更快。D-loop區的 5′端顯示了硬骨魚類之間高水平的核苷酸替換, 有利于研究種內變異[15]。因此可以利用線粒體基因D-loop控制區研究花鰻鱺群體內部的遺傳結構、親緣關系。

本研究利用線粒體DNA的D-loop控制區首次比較分析了海南群體和菲律賓群體花鰻鱺的遺傳多樣性和系統進化關系。為了解花鰻鱺群體的遺傳多樣性和種群進化歷史提供更多的證據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與總基因組DNA的提取

2010年5月采集花鰻鱺玻璃鰻樣本共19尾, 取自中國海南海域(11尾)和菲律賓南部海域(8尾), 為玻璃鰻時期樣本, 體質量在123～465 g, 分別記為海南群體和菲律賓群體。采用常規“酚/氯仿”抽提法[16]從肌肉中提取花鰻鱺總DNA, 經乙醇純化、重溶后, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳結合 EB染色檢測所提取的DNA質量, 用儀器Eppendorf biophotomete (Eppendorf AG 22331 Hamburg) 測定DNA濃度。將提取的DNA于-20℃保存備用。

1.2 PCR擴增和序列測定

根據GenBank中花鰻鱺mtDNA的D-loop基因序列片段(登錄號： NC006540), 用Primer premier 5.0軟件設計特異性引物。引物序列為 D-loop F： 5′-CGAGTAGAACCGTAGAAGTCA-3′和 D-loop R：5′-TCCATCCTCAACTCCCGAAG-3′。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應總體積為20 μL, 其中 200 μmoL/L dNTP、2.5 μL 10×buffer、2 μmoL/L MgCl2、0.4 μmoL/L 引物(各 0.2 μmoL/L)、2 U TagDNA聚合酶、20 ng DNA模板, 并用超純水補充體積。PCR反應程序為： 94℃預變性5min; 94℃變性1 min, 54℃退火30 s, 72℃延伸1 min20 s, 共35個循環; 最后72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠成像系統觀察, 對擴增的片段進行確認。PCR產物用OMEGA公司膠回收試劑盒純化后, 由上海 Invitroge公司進行測序反應。為保證序列的準確性, 序列經過正反兩次重復測定。

1.3 D-loop分析

采用Contig-Express軟件對正、反向序列進行重疊區拼接, 除去多余的堿基片段。用BioEdit軟件分析堿基含量。采用DNAsp4.0軟件對多態位點數、單倍型數、轉換與顛換數、核苷酸多樣性指數(Pi)、單倍型多樣度(Hd)、平均核苷酸差異數(k)、平均遺傳距離(P)等遺傳多樣性參數進行計算。并利用中性檢驗研究花鰻鱺的種群歷史。用 Mega5.0軟件進行遺傳距離計算和聚類分析。系統樹采用NJ模型進行構建, 并用并采用 bootstrap(重復次數 1000)檢驗聚類樹各分支置信度。

2 結果分析

2.1 群體序列多樣性

本研究檢測的19個樣本中, 經校對得到長度在1017～1020 bp的同源序列。A、T、G、C堿基平均含量分別為 39.8%、28.3%、12.4%、19.4%。其中A+T含量(68.1%)明顯高于 G+C含量(31.8%)。所有序列的共檢測到73個核苷酸變異位點, 共存在18種單倍型(HN6和HN10共享同一個單倍型)。所有突變位點中存在4個缺失位點、4個顛換位點以及63個轉換位點。

2.1.1 海南群體序列多樣性

經測序得到11個海南群體的序列, 序列長度在1018～1020 bp, 平均長度為1019.18 bp。內部共檢測到 56個核苷酸位點變異, 占全序列的 5.49%。其中缺失位點4個, 2個位點發生顛換, 48個位點發生轉換, 平均轉顛換比為 24.0, 堿基替換與插入或缺失的比例為8.33。這些位點分屬于10個單倍型。

2.1.2 菲律賓群體序列多樣性

對菲律賓群體 8個樣本進行測序, 發現其序列長度在 1017～1020bp, 平均長度 1018.75bp。內部共產生堿基位點變異 48個, 占全序列的 9.93%。缺失位點1個, 3個顛換位點, 42個轉換位點。平均轉顛換比為 14.0, 堿基替換與插入或者缺失的比例為15.0。這些位點分屬于8個單倍型。

綜合 2個群體的分析結果, 發現它們的堿基替換位點明顯大于插入或缺失位點, 堿基替換中轉換又大于顛換。這完全符合線粒體基因組的進化規律。堿基轉換與顛換的比例是多重替換程度的一個標準, 可以衡量序列間自遺傳分化以來各個位點發生替換的飽和程度[17]。本研究中, 較高的平均轉顛換比顯示了群體間 D-loop基因的序列替換還沒有達到飽和。

2.1.3 群體遺傳多樣性及遺傳分化

用單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多態性(Pi)、平均核苷酸差異數(k)3個指標來衡量花鰻鱺 2個地理群體的遺傳多樣性(表1)。

表1 花鰻鱺2個群體的遺傳多樣性參數Tab. 1 Genetic diversities of two A. marmorata populations

結果顯示, 海南群體的Hd為0.982低于菲律賓群體(Hd為1.000); 海南群體花鰻的Pi為0.21577也低于菲律賓群體(Pi為0.26728)。表明這兩個群體具有較高的單倍型多樣性(Hd＞0.5), 和較高的遺傳多樣性(Pi＞0.05), 且菲律賓花鰻的遺傳多樣性更加豐富。

2.2 群體內和群體間的遺傳距離

根據 mtDNA D-loop區的序列, 用 Tamura-Nei的方法分析群體內部和群體間的遺傳距離(表2)。結果表明, 18個單倍型之間遺傳距離最大為0.7719, 最小為 0.0030; 總體平均遺傳距離(P)為 0.3203。其中海南群體(HN)的單倍型遺傳距離在 0.0059～0.6905,菲律賓群體(PH)的單倍型遺傳距離在0.0059～0.5989,兩個群體之間的遺傳距離在 0.0030～0.7719。較大的遺傳距離, 表明花鰻鱺的遺傳多樣性較高。遺傳距離的最大值和最小值都出現在群體間, 可以推測兩個地理群體之間的遺傳分化尚不完全。

表2 基于花鰻鱺種群D-loop序列18個單倍型之間的遺傳距離矩陣(左下角為遺傳距離, 右上角為標準誤)Tab. 2 Genetic distances (lower-left) and SE (what is se short for, should give the full name the first time it appears)(upper-right) among A. marmorata populations

2.3 系統發育結果

基于線粒體基因 D-loop控制區的全序列, 從GenBank上下載南半球和北半球赤道附近的 5個地理群體花鰻(斐濟群體(FJ); 塔希提島群體(TH); 關島群體(GU); 蘇拉威西島群體(SU); 臺灣群體(TW))的D-loop區序列(表3), 與本研究的2個地理群體(海南群體,菲律賓群體)的 18種單倍型一同進行系統發育分析。本研究使用 MEGA5.0軟件中的 Kimura 2-parameter型構建花鰻鱺 NJ分子系統樹(鄰接樹,圖 1)。

結果顯示所有的花鰻鱺群體可以明確分成兩大支, 海南群體、菲律賓群體、臺灣群體和蘇拉威西島群體聚為一支, 而余下的斐濟群體、塔希提島群體和關島群體聚為另外一支。與各群體的地理分布結果一致。這表明海南群體和菲律賓群體的親緣關系較近, 同屬于北半球花鰻群體分支。

2.4 花鰻鱺種群歷史分析

選擇 Tajima[18]提出的D檢驗和 Fu[19]提出的Fu檢驗兩種中性檢驗對花鰻鱺的種群歷史進行分析。中性檢驗值 Tajima’sD(海南群體D=1.35345,P＞0.01;菲律賓群體D=0.79220,P＞0.01) 和Fs(海南群體Fs=3.759; 菲律賓群體Fs=2.231) 都為正, 且檢驗結果均不顯著。暗示著海南和菲律賓的花鰻鱺群體在進化過程中可能經歷了平衡選擇的作用, 且群體大小維持穩定狀態, 并未出現群體擴張或持續增長。

表3 花鰻鱺5個地理群的位置及GenBank號Tab. 3 Locations and the GenBank Accession numbers of the control regions in A. marmorata populations

3 討論

3.1 花鰻鱺線粒體D-loop控制區的序列分析

圖1 花鰻鱺mtDNA單倍型NJ分子系統樹Fig. 1 NJ phylogenetic tree of mtDNA haplotypes in A.marmorata

本研究首次通過分析線粒體DNA的差異探討了海南群體和菲律賓群體花鰻鱺的遺傳多樣性。本研究選取兩個地理群體(海南群體和菲律賓群體)共 19尾花鰻鱺樣本, 測序得到平均1019bp的堿基序列。分析兩個花鰻鱺群體的線粒體D-loop基因序列表明,平均 A+T含量為 68.1%, 明顯高于 G+C含量(31.8%)。這一結果與多數魚類線粒體控制區的研究結果一致[20]。19個花鰻鱺樣本共存在18種單倍型,海南群體內部有兩個個體(HN4和HN10)共享一個單倍型。兩群體之間均表現出各自獨有的單倍型, 無共享單倍型存在。說明花鰻鱺各群體遺傳多樣性豐富,反映了花鰻鱺線粒體控制區進化速度快、序列變異大的特點。

兩個地理群體內部的堿基突變結果顯示, 海南花鰻鱺群體內部存在56個核苷酸位點變異, 而菲律賓群體則存在48個位點變異, 分別占群體之間總變異數的76.71%和65.75%。說明花鰻鱺的遺傳變異主要存在于群體內部, 群體間的遺傳變異較弱。在兩個群體的線粒體控制區發現了共同的插入堿基, 暗示了它們之間存在一定程度基因交流。本研究中, 兩個群體花鰻鱺的堿基轉換位點明顯多于顛換位點, 完全符合線粒體基因在進化過程中發生轉換的頻率通常遠大于顛換頻率且進化速度較快這一規律, 較高的平均轉顛換比也表明花鰻鱺群體間D-loop基因序列替換尚未達到飽和, 推測花鰻鱺的這兩個地理群體之間發生遺傳分化的時間較短。

3.2 海南和菲律賓花鰻鱺群體 mtDNA D-loop控制區的遺傳多樣性

線粒體DNA的遺傳多樣性主要反映在單倍型平均遺傳距離、單倍型多樣度以及核苷酸多態性 3個方面[21]。本研究發現花鰻鱺的單倍型平均遺傳距離為0.3203, 表明2個群體的變異極大, 遺傳多樣性極其豐富。遺傳距離的最大值(0.7719)和最小值(0.0030)都出現在群體間, 可以推測 2個地理群體之間的遺傳分化尚不完全。海南群體的單倍型多樣度為0.982低于菲律賓群體(Hd為1.000), 表明這2個群體具有較高的單倍型多樣性(Hd＞0.5), 且菲律賓群體的單倍型更加豐富。Nei認為種群內部能夠維持較高的單倍型多樣性的原因可能在于較大的種群數量、環境的不均一性或者能夠適應種群快速增長的生活習性[22]。海洋是一個大的開放型環境, 對海水魚類而言,種群數量越大其維持遺傳多樣性的能力就越大[21]。而花鰻鱺廣泛分布于西印度洋到南、北太平洋的熱帶和亞熱帶區域[2], 其種群數量極其龐大, 這可能是花鰻鱺維持其較高的遺傳多樣性的原因之一。

本研究發現海南群體花鰻的核苷酸多態性為0.21577低于菲律賓群體(Pi為0.26728)。顯示了花鰻鱺較高的遺傳多樣性(Pi＞0.05), 且菲律賓花鰻的遺傳多樣性更高。菲律賓群體較高的單倍型以及豐富的遺傳多樣性可能與其洄游路徑有關。菲律賓花鰻的葉狀幼體從產卵場隨洋流游至菲律賓-印度尼西亞區域要經過較多個海峽, 再加上東南亞板塊活躍的地理史[23], 導致菲律賓群體比海南群體花鰻鱺要經歷更多的環境變化。此外, 近年來中國花鰻鱺種質資源下降(已被列為國家二級保護動物), 使得海南群體花鰻的遺傳多樣性降低。

不論是海南群體還是菲律賓群體, 它們的單倍型多樣度都明顯高于核苷酸多態性, 表明這 2個群體是由一個有效群體分化而來, 盡管在進化過程中積累了單倍型多態性, 但還不能使核苷酸序列多樣化。結合Ishikawa[9]和 Katsuni[24]的研究成果, 可以推測海南群體花鰻和菲律賓群體都屬于北太平洋群體。

3.3 花鰻鱺系統發育分析

線粒體基因進化速度比核基因快的多, 而D-loop區是線粒體基因中進化速度最快的區域, 能夠提供更多的信息位點[25]。本研究通過鄰位連接法構建的分子系統樹, 發現各單倍型的節點支持率相對較高(圖 1), 表明利用線粒體 DNA D-loop控制區可以有效的進行花鰻鱺系統發育學研究。圖 1涉及的花鰻鱺主要來自北半球和南半球兩大地理類群。NJ分子系統樹顯示南、北半球明顯的分為兩大支——南半球群體聚為一支, 北半球群體聚為另一支。盡管所算選取的花鰻鱺的地理位置都位于赤道附近, 但海南群體和菲律賓群體在分類上仍屬于北半球群體。圖 1也表明海南群體和菲律賓群體花鰻的親緣關系非常近?；狑~具有洄游路徑短、產卵周期長、生長快速等特點[12-13]。Ishikawa[26]認為花鰻鱺存在多個產卵場, 南北半球不同的花鰻鱺群體可能來自于不同的產卵場。由于線粒體基因屬于母系遺傳, 由此作者推斷花鰻鱺的海南群體和菲律賓群體同屬于北太平洋群體, 他們都來自位于北太平洋西部的產卵場[10-11]。序列分析結果也顯示花鰻鱺之間可能存在較多的基因交流?；蚪涣髟谀撤N程度上會阻礙群體間的遺傳分化[27]。因此可以推測, 北半球的花鰻鱺群體發生不完全分化的時間較短。這與Katsuni[24]的關于花鰻鱺群體分化時間的結論一致, 也符合Maes[28]認為鰻鱺屬魚類起源較晚、演化速度較慢的觀點。

3.4 花鰻鱺種群歷史分析

種群歷史主要包括種群擴增, 瓶頸效應, 奠基者效應, 群體縮減、分割和群體間的基因交流等。Kimura[29]在1968年提出了中性進化理論, 認為基因中的變異多數是中性的。遺傳漂變、中性突變、群體大小的變化以及種群遷徙等隨機事件是物種進化的主要動力。根據 Tajima[18]提出的中性檢驗方法(D檢驗), 若檢驗得到顯著結果, 則偏離了中性模型,表明種群的遺傳變異不單純是由隨機漂變造成的。而 Fu[19]提出的 Fu檢驗則是運用了種群遺傳學溯祖理論, 對變異在不同分化時間上進行比較, 看是否符合中性檢驗。本研究顯示兩個地理群體的兩種中性檢驗結果都為正值, 且沒有顯著差異(P＞0.01), 表明花鰻鱺在群體進化過程中自然選擇中的平衡選擇起主要作用, 在進化史上并未出現群體擴張或持續增長, 群體大小保持穩定。

本研究發現這兩個群體的花鰻鱺在進化過程中群體大小穩定、單倍型多樣性高、遺傳多樣性高, 意味著具有較強的環境適應潛能以及生存、進化能力,對鰻鱺屬魚類種質資源的保護起到積極的作用。但從長遠角度來看, 過度捕撈、水體環境污染會對其種質資源造成破壞, 攔河建壩以及水庫、水電站的建立也會阻礙花鰻鱺的洄游路徑, 使其遺傳多樣性降低。在中國, 花鰻鱺已列為國家二級保護動物。由于缺乏歷史數據, 本研究尚不能確定花鰻鱺的遺傳多樣性是否由于過度捕撈等消極因素而受到影響。但是合理利用花鰻鱺資源, 制定可持續發展的保護措施,對于推動水產業的發展具有積極的意義。

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Genetic variation and population evolutionary history of the giant mottled eel (Anguilla marmorata) based on the mitochondrial D-loop gene

DING Xu1, QI Xin1, YIN Shao-wu2
(1. The Ocean College of Hainan University, Haikou 570228, China; 2. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)

Oct., 14, 2011

Anguilla marmorata; Hainan and the Philippines populations; mitochondrial D-loop gene; genetic diversity; population history

The population genetic structures of the giant mottled eel from Hainan and Philippines were investigated by sequencing the mitochondrial control region (D-loop) gene for the first time. The average contents of A, T, G and C in the control region were 39.8%, 28.3%, 12.4% and 19.4%, respectively. There were 73 polymorphisms sites from the sequenced samples revealing 18 haplotypes. By calculating the haplotype diversity (Hd), nucleotide diversity (Pi) and average number of pairwise nucleotide difference (k), the Philippines population exhibited higher level of variability (Hd=1.000, Pi=0.26728, k=271.821) than the Hainan population (Hd=0.982, Pi=0.21577, k=219.655 and the genetic distance (P) was 0.3203 between two populations. By constructing the molecular phylogenetic tree with the method of NJ, the two geographic populations of the giant mottled eel did not show significant genetic difference. Besides, neutrality tests indicated a possible stable population in the population history of the giant mottled eel.

S921

A

1000-3096(2012)05-0117-07

2011-10-14;

2011-12-17

“十一五” 國家科技支撐計劃重點資助項目(2007BAD29B03); 江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

丁旭(1987-), 女, 碩士研究生, 主要從事魚類種質資源與遺傳育種研究, E-mail： athena1468@yahoo.com.cn; 尹紹武, 通信作者, 教授, E-mail： yinshaowu@163.com

(本文編輯：譚雪靜)