1株中度嗜鹽菌質?；蚪M文庫的構建及2個膜蛋白基因的克隆和序列分析

朱文華，董冠群，滕長財，侯 娟，呂 彥，孫業盈*

(1.濱州醫學院 藥學院，山東 煙臺 264003;2.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005)

中度嗜鹽菌(modrately halophilic bacteria)近年來正受到越來越多的重視，與此相關的中度嗜鹽菌的分離，鑒定，基因組學研究以及耐鹽機理的研究也日益廣泛和深入。中度嗜鹽菌是生活在極端高鹽環境中的微生物，具有較強的耐鹽能力，能在含有0% ～32%NaCl的環境中生長，最適鹽度為3% ～15%［1-2］。中度嗜鹽菌廣泛分布在不同的高鹽環境中如鹽湖、海洋、鹽堿地和鹽漬發酵食品等［3-6］。嗜鹽細菌主要通過2種機制來適應高滲透壓的外界環境:一種是通過在細胞內積累高濃度的鹽離子如KCl和NaCl等，來使細胞內的滲透壓升高，從而平衡外界環境的高滲透壓，如Halobacteriaceae和Salinibacter類嗜鹽菌都是通過此機制來實現耐鹽的;另一種是通過在細胞內合成或者積累高濃度的相容性溶質，來升高細胞內的滲透壓，抗衡細胞外的高滲透壓對細胞的影響［7］。雖然，目前研究人員已經發現了部分嗜鹽菌的耐鹽策略，但是對其如何通過怎樣的基因表達調控網絡來實現這一過程還不清楚。因此對嗜鹽菌進行深入的基因組學，轉錄組學和蛋白組學的研究，發掘克隆相關的基因，對它們進行功能研究就顯得尤其重要。先前的研究中從蜢子蝦醬中分離純化鑒定了1株中度嗜鹽菌，通過測定其16S rDNA序列，并通過系統發育分析將該菌初步鑒定為枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)中的鹽脫氮枝芽胞桿菌(Virgibacillus halodenitrificans)［8］。本研究進一步通過構建該中度嗜鹽菌的質?；蚪M文庫，經測序，比對分析克隆了2個膜蛋白基因，并對它們進行了生物信息學的相關分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 嗜鹽菌提取于天然發酵的蜢子蝦醬，購買于山東省煙臺市煙臺大學農貿市場。質粒pUC19，具有氨芐青霉素抗性。

1.1.2 試劑 HindⅢ-HF內切酶、T4DNA連接酶購自 NEB公司;Taq酶、CIAP(Alkaline Phosphatase)購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA的提取，酶切與酶切片段純化用BioTeKe Corporation細菌基因組提取試劑盒提取嗜鹽菌MKY20的總DNA，然后用限制性內切酶HindⅢ-HF處理，建立50 μL的反應體系，酶切2 μg細菌基因組DNA;將酶切片段經瓊脂糖凝膠電泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Exraction Kit回收片段大小為1.5～9 kb的DNA片段。

1.2.2 載體制備 提取適量的pUC19質粒以限制性內切酶HindⅢ-HF完全酶切后，試劑盒回收，然后用CIAP進行去磷酸化處理，抑制質粒的自身環化，降低假陽性克隆的比率。

1.2.3 連接與轉化 通過T4DNA連接酶連接經脫磷酸處理的pUC19質粒載體與酶切DNA片段。將得到的連接產物加入到100 μL大腸埃希菌感受態細胞中，置冰浴30 min;冰浴后放入42℃的恒溫水浴鍋中熱擊90 s，熱擊處理后迅速加入0.7 mL LB培養液，放置在37℃的恒溫搖床中震蕩培養1 h，然后取0.1 mL轉化菌液涂布固體LB平板于37℃過夜培養。

1.2.4 載體插入片段大小的鑒定 隨機挑取轉化培養的單克隆，以其 DNA為模板，利用M13(47)和M13(48)引物進行菌落PCR，然后把PCR擴增后產物進行瓊脂糖凝膠電泳，和DNA Maker比對確定片段大小。

1.2.5 測序與比對分析 隨機選取一定數量的插入片段的克隆，送上海美吉生物科技公司測序。經生物學軟件分析，篩選具有完整的開發閱讀框(ORF)的克隆。用DNASTAR軟件推導ORF編碼的氨基酸序列，提交到GenBank進行BLAST比對，對ORF所編碼的蛋白質的同源性進行分析。將部分ORF編碼的氨基酸序列和其它物種的該蛋白的氨基酸序列用ClustalW比對?？缒^的預測通過在線程序 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/進行。

2 結果與分析

2.1 中度嗜鹽菌基因組DNA的提取，酶切和片段富集

提取中度嗜鹽菌MKY20總DNA，經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖1，DNA片段大小在23.1 kb左右。用限制酶 HindⅢ-HF酶切總DNA，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2，第一泳道所示，片段大小不一，彌散分布。切膠回收1.5～9 kb之間的片段，經電泳檢測，如圖2第二泳道所示，結果表明大片段明顯集中，去除掉了小于1.5 kb的片段。

2.2 質?；蚪M文庫的構建及陽性克隆的檢測

酶切后回收大小在1.5～9 kb的片段，然后與PUC19質粒載體(經HindⅢ-HF酶切并進行去磷酸化處理)連接，連接產物轉化大腸埃希菌DH5a，構建中度嗜鹽菌MKY20的質?；蚪M文庫。隨機挑選轉化單克隆菌落，用載體引物M13(47)和M13(48)進行PCR擴增，鑒定插入片段大小，經凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，插入片段大小都在2～4 kb，重組質粒占總轉化質粒的90%以上，證明了基因組質粒文庫的可靠性。由此估算該基因組文庫的容量大約為5×103個克隆，以平均每個克隆插入3 kb計算，該文庫可覆蓋約15 Mb的遺傳信息。

2.3 NhaC基因的克隆及序列分析

從中度嗜鹽菌MKY20的質?；蚪M文庫中某個隨機測序的克隆中獲得了一完整的ORF，經過BLAST比對分析表明該ORF所編碼的蛋白質與Na+H+逆向轉運蛋白(Na+H+antiporter，NhaC)相似，該蛋白存在于單細胞的原核生物到多細胞的真核生物的細胞質膜上，起到調節細胞內pH值和Na+濃度的功能［9-11］。進一步的生物信息學分析表明中度嗜鹽菌MKY20 NhaC基因全長ORF為1446 bp，編碼481個氨基酸的蛋白質，推測的分子量為50.5 ku，共10個跨膜區域(圖4)，GenBank登陸號為JX849200。

2.4 MscS基因的克隆及進化分析

在質?；蚪M文庫中隨機測序的克隆中獲得了另外一個具有完整的ORF的克隆，經BLAST比對分析表明該ORF所編碼的蛋白質分別與一離子通道蛋白(small conductance mechanosensitive channel，MscS)具有較高的同源性。該MscS基因的全長ORF為822 bp，編碼273個氨基酸的蛋白質，推測分子量為 30.0 ku，GenBank登陸號為JX849202。采用ClustalW軟件，對該菌的MscS蛋白的氨基酸序列與GenBank中其他4種菌的MscS蛋白相應氨基酸序列進行了比對分析(圖5)，結果表明中度嗜鹽菌MKY20的MscS蛋白與其他4種菌的MscS蛋白有較高的同源性，并且都具有3個跨膜區，其中第3個跨膜區的氨基酸序列最保守。

圖5 不同菌屬MscS蛋白氨基酸序列的比對分析Fig.5 Alignment analysis of MscS amino acid sequence from different species

3 討論

本研究的實驗對象是從蜢子蝦醬中分離出來的1株中度嗜鹽菌，經16S rDNA測序比對以及生理生化的鑒定，確定為鹽脫氮枝芽胞桿菌(Virgibacillus halodenitrificans)。目前，還沒有該菌種基因組學方面的研究報道。細菌的基因組大小一般在4 M左右，因此本研究在構建鹽脫氮枝芽胞桿菌基因組文庫時選擇了能夠承載幾個kb的質粒載體。由于小片段包含的遺傳信息比較小，并且小片段相比大片段插入質粒的概率要大的多，因此為了使每個克隆盡可能的包含更多的遺傳信息，在構建文庫之前，對酶切的基因組片段進行了篩選，只選擇了大于1.5 kb的酶切片段進行文庫構建，文庫鑒定結果也表明所構建的基因組文庫的克隆中插入片段均大于1.5 kb，這樣就保證了每個克隆的遺傳信息的承載量，便于從克隆中篩選基因全長。

Na+H+逆向轉運蛋白(antiporter)是存在于質膜上的一類蛋白家族，在包括微生物、植物、動物和人中都存在，它們在維持細胞內部pH、Na+濃度等方面起著重要的調節作用［9］。在植物和微生物的研究中均已表明Na+/H+逆向轉運蛋白是生物耐鹽的關鍵因子，能夠維持高鹽脅迫下生物體的正常生長代謝［10-11］。本研究中從鹽脫氮枝芽胞桿菌的質?；蚪M文庫中篩選到Na+H+逆向轉運蛋白，經比對分析確定為NhaC，鑒于NhaC在其他微生物中已被證明具有耐鹽功能［12］，因此本研究所克隆的鹽脫氮枝芽胞桿菌的NhaC基因可作為該菌的一個候選耐鹽基因。機械敏感性離子通道(Mechanosensitive(MS)ion channels)存在于從單細胞的微生物到多細胞的動植物的質膜中，可以察覺細胞外的機械性的脅迫如重力，接觸等，還可以對細胞內環境如滲透壓力和膜損傷起反應［13］。大腸埃希菌是目前研究機械敏感性離子通道的最好模型，該蛋白可以分為2類，一類是MscL(Mechanosensitive channel of Large conductance)，另一類是MscS(Mechanosensitive channel of Small conductance)［13］。研究表明MS通道在細菌滲透脅迫中具有重要的保護作用［14］，因此，推測MS通道在高鹽環境中生存的微生物自我保護也是必不可少的。在鹽脫氮枝芽胞桿菌的質?；蚪M文庫中篩選到了一MscS基因，故該基因也可作為該菌的一個耐鹽候選基因。鹽脫氮枝芽胞桿菌質?；蚪M文庫的構建以及2個膜蛋白基因的克隆，將為進一步研究鹽脫氮枝芽胞桿菌的耐鹽機制，及其在鹽漬食品中的作用提供了基礎。

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