漢坦病毒76-118株M2基因的克隆及蛋白表達

王美蓮，劉 兵，史俊巖，鄭蘭艷，羅恩杰

(中國醫科大學病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110001)

漢坦病毒(hantaan virus，HV)屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，由其引起的人類腎綜合癥出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是一類以發熱、出血和腎功能損傷為特征的急性傳染病，病死率達0.1% ～10%［1］。病毒不僅可以直接引起全身小血管和毛細血管損傷、血管通透性增加和微循環障礙，還可引起免疫應答異常，進而引發高熱、出血及腎損害等臨床癥狀。漢坦病毒主要編碼基因由S、L、M 3條單鏈負股RNA組成，它們分別編碼漢坦病毒核蛋白、RNA聚合酶、糖蛋白，而含M基因的重組體DNA可誘導產生中和抗體，并且對病毒株的攻擊有保護力。目前研究者已經對核蛋白的作用作了較深入的研究［2-3］。但對糖蛋白的研究相對較少。漢坦病毒M2基因上含有較多的抗原決定簇，因此如果可以大量的人工合成并提取G2蛋白對漢坦病毒糖蛋白單克隆抗體的研究及應用有重要的意義。本實驗以原核表達質粒pGEX-6P-1為載體，構建了含有漢坦病毒76-118株編碼囊膜糖蛋白G2抗原基因片段的原核表達載體pGEX-6P-1-M2，通過研究其在原核細胞中的表達，探討漢坦病毒糖蛋白在篩選單克隆抗體及研制試劑盒中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 原核表達載體pGEX-6P-1、漢坦病毒76-118 株 M 片段、E.coli DH5α、E.coli BL21為本教研室保存。

1.1.2 引物的設計與合成 引物參照GenBank設計，由沈陽博奧春天生物公司設計并合成。序列如下:上游引物:5'-CGTGTTACCGGACACTAA-3'，BamHⅠ酶切位點;下游引物:5'-CCGAGTCACAGAATTTAGC-3'，XhoⅠ 酶 切位點。

1.1.3 主要試劑 限制性內切酶 EcoRⅠ及T4DNA連接酶、DL 15000 DNA Marker、小量 DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、預染蛋白Marker購自大連TaKaRa公司;辣根過氧化物酶標記羊抗人抗體、瓊脂糖購自BIOWEST公司。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白表達載體pGEX-6P-1/M2的構建 以漢坦病毒76-118株M基因為模板進行PCR反應，擴增得到含完整編碼漢坦病毒G2蛋白基因M2的1600 bp DNA片段，凝膠回收后－20℃保存。

1.2.2 質粒pMD18-M2的構建 將上述PCR產物與T載體pMD18分別經XhoⅠ和BamHⅠ消化后，在連接酶的作用下16℃連接約16 h。連接產物10 μL轉化入感受態大腸埃希菌DH5α，鋪LB平板并加入氨卞青霉素(1 μg/mL)，37℃培養16 h;篩選陽性菌落擴增培養，以堿裂解法小量提取重組質粒后，儲存于－20℃。

1.2.3 原核表達載體 pGEX-6P-1-M2的構建將重組質粒及原核表達載體pGEX-6P-1均用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后在T4DNA連接酶作用下于16℃連接約16 h。連接產物10 μL轉化入感受態大腸埃希菌DH5α，鋪LB平板并加入氨卞青霉素(1 μg/mL)，37 ℃培養16 h。

1.2.4 重組質粒的轉化、篩選及鑒定 按常規方法，將連接后所得的重組子轉化入感受態宿主菌E.coli BL-21，在含氨芐青霉素LB平板上鋪板，37℃溫箱過夜培養。第2天從平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的5 mL LB液體培養基，37℃搖床震蕩培養5 h，快速堿裂解法粗提質粒，－20℃保存。

1.2.5 重組蛋白GST-G2的誘導表達和純化將含重組質粒pGEX-6P-1-M2的大腸埃希菌BL-21接種于含氨芐青霉素的LB培養基中，于37℃振蕩培養過夜。次日將過夜培養物轉接于1000 mL含氨芐青霉素的LB培養基中，繼續在37℃振蕩培養約3 h。加入 IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，置37℃繼續培養4 h，離心，收集菌體。加細菌裂解緩沖液超聲裂解細菌，離心取上清，對融合蛋白進行親和層析純化。

1.2.6 SDS-PAGE電泳及 Western-Blot分析 取純化后的蛋白產物進行SDS-PAGE電泳，1 h后，取下凝膠進行轉印，PVDF膜經TBS液洗滌10 min后，封閉液封閉1 h，再以TTBS洗滌2次。加入用1∶200封閉液稀釋的患者血清，4℃孵育過夜，經TBS、TTBS洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記二抗 37℃ 孵育 2 h，TTBS、TBS洗滌，DAB顯色。

2 結果與分析

2.1 M2基因片段的擴增

經PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳可見1條約1600 bp的特異性擴增區帶，與預期結果一致(圖1)。

圖1 PCR產物M2的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products M2

2.2 pMD18-M2重組質粒的酶切鑒定

用EcoRⅤ和BamHⅠ雙酶切質粒，酶切產物經1%瓊脂糖電泳證明重組質粒帶有相應的目的基因(圖2)。質粒交由北京三博遠志生物公司測序。將測序結果與GenBank中的M2核苷酸序列進行比較，同源性達98%，開放讀碼框正確。

圖2 pMD18-M2重組質粒的酶切鑒定Fig.2 Results of recombinant plasmid pMD18-M2

2.3 pGEX-6P-1-M2重組質粒的酶切鑒定

從陽性克隆中提取重組質粒，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到4900 bp和1600 bp 2條帶，表明M2基因已克隆于pGEX-6P-1載體中(圖3)。

圖3 pGEX-6P-1-M2重組質粒的酶切鑒定Fig.3 Results of recombinant plasmid pGEX-6P-1-M2

2.4 融合蛋白的誘導表達及純化

SDS-PAGE電泳結果可見與預期融合蛋白分子量大小相符的蛋白條帶(圖4)。Western-Blot分析進一步表明該蛋白條帶為GST-G2融合蛋白(圖5)。

圖4 pGEX-6P-1-M2重組菌的誘導表達及純化SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE result of inducted expression and purification for recombined bacteria pGEX-6P-1-M2

圖5 Western-Blot結果Fig.5 Result of Western-Blot

3 討論

漢坦病毒糖蛋白由 G1、G2組成，其具有重要的生物學功能，除了能與細胞膜上受體黏附、融合之外，更重要的是具有誘導機體產生中和抗體的抗原決定簇。最近發現，包膜糖蛋白上亦含有 CTL的表位［4］。對抗糖蛋白G1或G2的單克隆抗體研究發現，只有識別糖蛋白G2的單克隆抗體能產生血凝抑制反應，體外具有中和病毒抗原活性，而針對核殼蛋白(NP)的單克隆抗體絕大多數無中和活性［5-6］。雖然人們普遍認為漢灘病毒G2上的抗原位點對空間結構和糖基化依賴性較大，但仍然存在一定的由一級結構決定的中和位點。

本研究以pGEX-6P-1為載體，以編碼漢坦病毒G2蛋白的M2基因為目的基因，構建原核表達載體pGEX-6P-1/M2，酶切和序列分析結果表明成功構建原核表達載體pGEX-6P-1/M2。為了獲得足夠量的蛋白用以進一步的研究，選用簡便、高效及生產成本低的原核表達系統載體pGEX-6P-1。表達載體一般分為原核和真核兩大類，是外源基因在宿主細胞中進行蛋白表達的主要工具，是將克隆的外源基因在宿主細胞內表達成蛋白質的載體。原核表達載體系統包括大腸埃希菌和枯草桿菌系統等，真核表達載體系統包括酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞系統等［7］。大腸埃希菌表達系統使用最早也研究最多，并且其遺傳背景相對比較清楚，使用安全、操作簡便、周期短［8］。大腸埃希菌表達載體有非融合表達、融合表達、分泌表達、帶純化標簽表達、帶伴同蛋白表達和表面呈現表達等［9］。融合蛋白是將2個各自獨立的基因，通過表達載體使之連接成一體，表達2種不同蛋白的融合體。融合表達具有多方面的優點:如防止包涵體的形成，促進蛋白質的正確折疊，限制蛋白酶解和利于純化［10-11］。近年來，融合蛋白表達系統的發展為E.coli中高效表達和純化重組蛋白提供了極大方便，GST(glutathione stransferase)是目前成功的融合表達系統［12-15］。原核表達載體pGEX-6P-1具有:①含有tac啟動子，可使被克隆的基因得到可誘導的高水平表達;②含有lac Iq基因，適用于任何大腸埃希菌宿主;③含有凝血酶或Xa因子蛋白酶識別位點，可使目的蛋白從表達的融合蛋白中達到分離純化。SDS-PAGE電泳顯示，經IPTG誘導的重組原核表達質粒pGEX-6P-1/M2在大腸埃希菌BL-21中獲得了高效表達的融合蛋白，證明原核表達載體pGEX-6P-1適用于漢坦病毒M2基因的原核表達研究。

通過Western-Blot分析融合蛋白GST-G2，結果證實重組蛋白GST-G2具有抗原性。

總之，本研究中以原核表達載體pGEX-6P-1為載體，成功構建了漢坦病毒M2基因原核表達載體，并獲得了高效表達的具有生物學活性的重組融合蛋白，為將來篩選漢坦病毒抗體庫以及漢坦病毒早期診斷試劑盒的研制奠定了基礎。

［1］Hooper JW，Kamrud KI，Elgh F，et al.DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and protects against seoul virus infection［J］.Virology，1999，255(2):269-278.

［2］Van Epps HL，Schmaljohn CS，Ennis FA.Human memory cytotoxic T-lymphocyte(CTL)responses to Hantaan virus infection:identification of virus-specific and cross-reactive CD8(+)CTL epitopes on nucleocapsid protein［J］.J Virol，1999，73(7):5301-5308.

［3］Cormack BP，Valdivia RH，Falkow S.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)［J］.Gene，2006，173(1):33-38.

［4］Duenas M，Malmborg AC，Casslvilla R，et al.Selection of phage displayed antibodies based on kinetic constants［J］.Male Immunal，1996，33(3):279-285.

［5］Wang M ，Pennock DG，Spik KW，et al.Epitope mapping studies with neutralizing and non-neutralizing monoclonal antibodies to the G1 and G2 envelope glycoproteins of Hantaan virus［J］.Virology，1993，197(2):757-766.

［6］Arikawa J，Yao JS ，Yoshimatsu K，et al.Protective role of antigenic sites on the envelope protein of Hantaan virus defined by monoclonal antibodies［J］.Arch Virol，1992，126(1-4):271-281.

［7］Goeddel DV.Systems for heterologous gene expression［J］.Methods Enzymol，1990，185(2):3-7.

［8］Balbas P，Bolivar F.Design and construction of expression plasmid vectors in Escherichia coli［J］.Methods Enzymol，1990，185:14-37.

［9］Hockney RC.Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli［J］.Trends Biotechnol，1994，12(11):456-463.

［10］Makrides SC.Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli［J］.Microbiol Rev，1996，60(3):512-538.

［11］Ito W，Kurosawa Y.Development of a prokaryotic expression vector that exploits dicistronic gene organization［J］.Gene，1992，118(1):87-91.

［12］Sharrocks AD.AT7 expression vector for producing N-and C terminal fusion proteins with glutathione S-transferase［J］.Gene，1994，138(12):105-108.

［13］Smith DB，Johnson KS.Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase［J］.Gene，1988，67(1):31-40.

［14］Bill RM，Winter PC，McHale CM，et al.Expression and mutagenesis of recombinant human and murine erythropoietins in Escheric hia coli［J］.Biochim Biophys Acta，1995，1261(1):35-43.

［15］Ljungcrantz P，Carlsson H，Mansson MO，et al.Construction of an artificial bifunctional enzyme，beta-galactosidase/galactose dehydrogenase，exhibiting efficient galactose channeling［J］.Biochemistry，1989，28(22):8786-8792.