巨大芽胞桿菌的產酶特性及發酵條件的研究

匡 群，陳秋紅，孫 梅，張維娜，施大林，胡 凌，高 亮

(江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫 214063)

近年來，隨著人們對健康和環境保護的高度重視，無公害、無殘留的綠色微生態制劑成為研究的焦點，芽胞桿菌是微生態制劑的常用菌種，已廣泛應用于醫療、保健、食品、畜牧和水產等行業。常用的芽胞桿菌微生物制劑菌種有枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、納豆芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌等。巨大芽胞桿菌是生產生物有機肥的常用菌種，也是制作水體處理劑的常用菌種，它能降解一些頑固的難降解的殺蟲劑和土壤中的有機磷，可以用來生產解磷固鉀肥，對環境具有十分重要的作用［1-2］。另外，一些巨大芽胞桿菌能產生具有抑菌作用的蛋白質，可進一步提純抑菌蛋白作為農用抗生素，或者克隆其編碼基因用于抗真菌病害轉基因植物的研究等方面［3］。在工業上，巨大芽胞桿菌分泌的酶應用也十分廣泛，如淀粉酶應用于面包生產、青霉素酰胺酶應用于合成新型人工抗生素等［4］。由于芽胞具有較強的抵抗外界環境壓力的能力，能經受多種逆境影響，使芽胞桿菌具有很好的應用前景，因此芽胞是制備微生態制劑和生防菌制劑的理想存在形式［5］。本文對1株巨大芽胞桿菌JSSW-JD的產胞外酶特性進行研究，并對其產芽胞發酵條件進行優化，為該菌株的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 巨大芽胞桿菌JSSW-JD由江蘇省蘇微微生物研究有限公司生化工程研究室篩選保藏。

1.1.2 培養基 ①斜面種子培養基:營養瓊脂培養基;②搖瓶種子培養基:營養肉湯培養基;③搖瓶基礎培養基(g/L):葡萄糖 10.0，蛋白胨 5.0，酵母膏5.0，NaCl 5.0，pH 7.0 ～7.2;④活菌及芽胞檢測用培養基:PCA平板計數培養基;⑤淀粉水解培養基［6］(g/L):蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，牛肉膏3.0，可溶性淀粉2.0，瓊脂粉 15.0 ～20.0，pH 7.0～7.2;⑥酪素培養基［6］:取5.0 g 脫脂奶粉加入到50.0 mL 蒸餾水中，另稱 1.5 g 瓊脂溶于 50.0 mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌，待冷卻至45～50℃時，將兩液混勻倒平板，即成酪素培養基平板;⑦纖維素培養基［7］(g/L):K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.25，CMC-Na 1.88，剛果紅 0.2，瓊脂 16.0，明膠 2.0，pH 7.0;⑧油脂水解培養基［7］(g/L):蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，牛肉膏3.0，植物油 10.0，1.6%中性紅水溶液1.0 mL，瓊脂粉 15.0 ～20.0，pH 7.2 ～7.4(培養基 pH 調好后再加入 1.6% 中性紅溶液)。將滅菌后的油脂培養基充分震蕩，使油脂分布均勻，以無菌操作制成平板。

1.1.3 試劑 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、硫酸銨、NaCl、ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4、CaCO3、碘、碘化鉀、中性紅、剛果紅，以上試劑均為國產分析純試劑;蛋白胨、酵母膏為國產生化試劑;玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、豆粕粉、黃豆餅粉、玉米漿干粉為市售。

1.1.4 儀器 YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器，上海三申醫療器械有限公司;GJ-202潔凈工作臺，無錫市新達凈化成套設備廠;PYX-DHS-40X隔水式電熱恒溫培養箱，上海市躍進醫療器械一廠;123MB-1型光學顯微鏡，Nikon;HYG-Ⅱa迴轉式恒溫調速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設備有限公司;Delta320 pH計，梅特勒-托利多;DK-S24恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 ①種子培養:無菌開啟菌株JSSW-JD的凍干保藏菌種，劃線接種于營養瓊脂試管斜面，30℃培養24～48 h，然后再轉接1次活化，從轉接的新鮮斜面種子中用接種環挑取1環菌泥接種至裝液量為50 mL的500 mL三角瓶中，30℃，200 r/min，回轉搖床振動培養24～48 h;②搖瓶培養:將新鮮的種子液以5%的接種量接入搖瓶培養基，250 mL三角瓶裝液體積為25 mL，30℃，200 r/min的回轉搖床培養48 h;③擴大培養:a.100 L種子罐培養:按搖瓶培養所獲得的最佳培養基和培養條件，于100 L種子罐中進行培養，種子罐的裝液體積為65% ～70%(體積比)，加消泡劑0.05%，攪拌轉速200 r/min，空氣流量4 m3/h，培養24 h;b.2 m3發酵罐培養:按搖瓶優化條件上罐，種子培養液以體積比5%的接種量接入2 m3發酵罐，發酵罐裝液體積為65%～70%(體積比)，加消泡劑0.05%，攪拌轉速100～120 r/min，空氣流量60 m3/h，30℃培養40～48 h，取發酵液進行鏡檢，當90%以上的菌體已形成芽胞時，即放罐結束培養。

1.2.2 測定方法 ①活菌總數的測定［6］:以傾注法進行活菌計數;②芽胞濃度的測定［8］:菌液于80℃水浴加熱15 min，殺死營養體細胞，采用傾注法進行芽胞計數;③芽胞率計算公式:芽胞率%=(芽胞數/活菌總數)×100%。

1.2.3 產酶特性測定［7，9］①淀粉酶檢測:將種子液點種于淀粉水解培養基上，每種菌液作3個重復，30℃培養24～48 h，將培養好的平板取出，滴加少量的盧哥氏碘液均勻覆蓋于培養基上，稍停片刻，觀察其菌落周圍形成的透明圈，測量菌落和透明圈的直徑，取其平均值，用公式Up=(D/d)2來表示水解能力的大小，D為透明圈直徑(mm)，d為菌落直徑(mm)，Up值越大，說明淀粉酶產酶能力越強;②蛋白酶檢測:將種子液點種于酪素平板培養基上，每種菌液作3個重復，30℃培養24～48 h，觀察記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明，測量菌落和透明圈的直徑，取其平均值，計算出透明圈直徑與菌落直徑之比，同樣用公式Up=(D/d)2來表示水解能力的大小，Up值越大，說明蛋白酶產酶能力越強;③纖維素酶檢測:將種子液點種于纖維素培養基上，每種菌液作3個重復，30℃培養24～48 h，在平板上出現透明圈的菌落為纖維素分解菌，具有產纖維素酶的能力，測量菌落和透明圈的直徑，取其平均值，同樣用公式Up=(D/d)2來表示水解能力的大小，Up值越大，說明纖維素酶產酶能力越強;④脂肪酶檢測:將種子液點種于脂肪酶培養基上，30℃培養24～48 h，取出平板，觀察平板底部，出現紅色小球則說明脂肪被水解，為陽性反應，記為“+”，否則為陰性，記為“－”，說明脂肪酶未被水解，結果見表1。

1.2.4 數據分析 試驗數據采用EXCEL2003進行處理，正交設計助手Ⅱ V3.1專業版軟件進行正交試驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 產酶特性測定結果

實驗結果表明，JSSW-JD在淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶鑒別培養基上均產生分解圈，且隨著培養時間的增長，分解圈增大，24 h透明圈與菌落面積比分別為 2.76、1.95、11.11，產酶能力由大到小依次是纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶，48 h透明圈與菌落大小比分別為 3.87、4.38、31.42，產酶能力由大到小依次是纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶;而脂肪酶鑒別培養基平板底部，未出現紅色小球，則說明脂肪未被水解，結果見表1。

表1 產酶特性測定結果Table 1 Results of enzyme production characteristics

2.2 發酵培養基優化

2.2.1 單因素試驗 ①碳源對菌株生長的影響:分別以10.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、紅薯淀粉作為基礎培養基的碳源，基礎培養基中其它成分不變，30℃，200 r/min，恒溫搖床振蕩培養48 h后，進行計數，結果見圖1。從圖1結果可以看出，巨大芽胞桿菌JSSW-JD對糖類、淀粉碳源都能利用，在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源的培養基中培養48 h獲得的菌體數及芽胞數均不高;而在玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉為碳源的培養基中培養48 h，獲得的菌體數及芽胞數均較糖類碳源高，綜合考慮最終獲得的菌體數及芽胞數，玉米淀粉為最高，因此選擇玉米淀粉作為碳源;②氮源對菌株生長的影響:分別以10.0 g/L的蛋白胨、玉米漿干粉、黃豆餅粉、酵母膏、豆粕粉、硫酸銨作為基礎培養基的氮源，基礎培養基中其他成分不變，30℃，200 r/min，恒溫搖床振蕩培養48 h后，進行計數，結果見圖2。從圖2可以看出:菌株JSSW-JD對有機氮源的利用率較高，以豆粕粉、酵母膏、玉米漿干粉作為氮源可獲得較高的菌體數和芽胞數;對無機氮源硫酸銨的利用較差，菌體數很低，且不形成芽胞。以豆粕粉作為氮源，最終獲得的菌體數及芽胞數均為最高，且豆粕粉作為氮源發酵成本較為經濟，因此選擇豆粕粉作為氮源;③無機鹽對菌株生長的影響:以玉米淀粉為碳源，豆粕粉為氮源，在基礎培養基中分別添加2.00 g/L 的 ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4及CaCO3，且以不添加無機鹽的處理組作為對照，30℃，200 r/min，恒溫搖床振蕩培養48 h后，進行計數。結果見圖 3，其中K2HPO4、CaCO3對菌株生長及芽胞形成有促進作用，ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O對菌株生長及芽胞形成影響不大，因此可考慮在培養基中添加K2HPO4、CaCO3以促進菌株生長及芽胞形成。

圖1 不同碳源對菌株JSSW-JD生長的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on growth of Bacillus megaterium JSSW-JD

圖2 不同氮源對菌株JSSW-JD生長的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on growth of Bacillus megaterium JSSW-JD

圖3 不同無機鹽對菌株JSSW-JD生長的影響Fig.3 Effect of different inorganic salts on growth of Bacillus megaterium JSSW-JD

2.2.2 培養基正交試驗 根據單因素試驗的結果，選用最佳碳源玉米淀粉、最佳氮源豆粕粉及無機鹽K2HPO4、CaCO3共4個因素，采用L9(34)正交試驗因素水平表進行培養基優化試驗(表2)。試驗結果與分析見表3、表4。

表2 培養基濃度正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of medium concentration orthogonal test

表3 培養基濃度正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of medium concentration

由表3中數據直觀分析得知，各因素極差大小為RA＞RB＞RD＞RC，培養基中影響芽胞數的各因素主次為A＞B＞D＞C，主要影響因子為玉米淀粉，其次為豆粕粉，K2HPO4和CaCO3對結果影響較小。根據方差分析(表4)，玉米淀粉、豆粕粉在α=0.05水平上對實驗結果的影響存在顯著性差異，最佳的組合是A2B2C3D3。但是在正交試驗表中沒有此組合，需進行驗證試驗。正交設計表中的試驗5為相近組合且在正交試驗中該組芽胞數最高，為此選試驗5與最佳組合的培養基進行驗證。結果顯示，最佳組合芽胞數達1.5×109cfu/mL，而試驗5芽胞數為1.1×109cfu/mL。因此，優化后的培養基為玉米淀粉10.0 g/L，豆粕粉10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，CaCO32.0 g/L。

表4 培養基濃度方差分析表Table 4 Analysis of variance table of medium concentration

2.3 發酵培養條件優化

得出優化的培養基之后，利用正交試驗研究pH值、溫度、接種量、裝液量對菌株生長及芽胞形成的影響，采用L9(34)正交表進行培養條件優化試驗(表5)。以上試驗每處理均重復3次，結果見表6、表7。對表6中數據直觀分析得知，各因素極差大小為RD＞RB＞RA＞RC，培養條件中影響芽胞數的各因素主次為D＞B＞A＞C，主要影響因子為裝液量，其次為培養溫度，pH和接種量對結果影響較小。根據方差分析(表7)，裝液量在α=0.05水平上對實驗結果的影響存在顯著性差異，在搖瓶發酵中，裝液量直接影響通氣量即溶氧，裝液量小即通氣量大可促進芽胞形成。最佳的組合是A2B2C3D1，此最佳組合也在試驗設計中，即試驗5，培養48 h，芽胞數為1.7×109cfu/mL，因此培養條件的最佳組合為初始pH 7.0，250 mL三角瓶裝液體積為25 mL，接種量5.0%，培養溫度30℃。

表5 培養條件正交試驗因素水平表Table 5 Factors and levels table of culture condition orthogonal test

表6 培養條件正交試驗結果Table 6 Orthogonal test results of culture condition

表7 培養條件方差分析表Table 7 Analysis of variance table of culture condition

2.4 2 m3發酵罐擴大培養試驗

根據上述優化試驗結果，在2 m3發酵罐進行巨大芽胞桿菌的擴大培養試驗，發酵罐裝液體積為65% ～70%(體積比)，種子培養液以體積比5%的接種量接入2 m3發酵罐，加消泡劑0.05%，攪拌轉速100～120 r/min，空氣流量60 m3/h，30℃培養48 h，試驗結果見圖4。接種后4 h內芽胞迅速萌發成生長旺盛的營養菌體;約8 h，菌體結束遲滯期，隨后進入指數期，生長旺盛，24 h左右就已結束對數生長期，進入平衡期，菌體濃度逐漸達到最高值3.9×109cfu/mL;在平衡期的中后期，菌體開始形成芽胞，芽胞率逐漸上升，培養40 h后，鏡檢可見芽胞成熟脫落，44 h芽胞計數達峰值3.8×109cfu/mL，芽胞率97.4%;44 h 后菌體進入衰亡期，菌體開始自溶，芽胞有失活跡象，芽胞數、芽胞率均有所下降，培養結束。因此，應在培養40 h后，鏡檢觀察芽胞成熟情況，及時判斷培養終點。上述試驗結果表明，巨大芽胞桿菌JSSW-JD在2 m3發酵罐中擴大培養效果良好，可將上述試驗獲得的最佳培養條件進一步應用于工業化大規模生產。

圖4 2 m3發酵罐培養曲線Fig.4 Time course of the cultivation in 2 m3fermentation tank

3 討論

本試驗通過對巨大芽胞桿菌JSSW-JD的產胞外酶特性的研究顯示，JSSW-JD在淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶鑒別培養基上均產生分解圈，且隨著培養時間的增長，分解圈增大，表明JSSW-JD具有較強的產胞外淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的能力，它的這一特性使其對有機物具有良好的分解能力，在提高飼料蛋白質和能量的利用率以及改善水體、土壤生態環境方面具有潛在的應用價值。

由于芽胞具有較強的抗逆性，在制備微生態制劑及生防菌制劑時，有利于產品的活性保持及保存運輸。因此，如何獲得高濃度的芽胞，對巨大芽胞桿菌的培養具有較大的實用意義。目前已有一些關于巨大芽胞桿菌發酵培養的報道，如:陳凱等［1］采用單因子實驗及正交試驗優化了巨大芽胞桿菌P1菌株的最佳發酵條件，并在10 L發酵罐上進行了發酵條件驗證，菌數達到6.0×109cfu/mL，芽胞比率達90%以上。郭曉軍等［10］通過搖瓶培養對毛竹枯梢病拮抗細菌巨大芽胞桿菌6-59菌株芽胞形成的發酵培養基和培養條件進行優化，在試驗獲得的優化條件下，6-59菌株發酵液中的芽胞數量為2.0×109cfu/mL，芽胞形成率達96.4%。本試驗為了獲得高濃度的芽胞，分別對巨大芽胞桿菌JSSW-JD的發酵培養基及培養條件進行了優化，優化后的最佳培養基組成為玉米淀粉10.0 g/L，豆粕粉10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，CaCO32.0 g/L。培養條件的最佳組合為初始 pH 7.0，250 mL三角瓶裝液體積為 25 mL，接種量5.0%，培養溫度30℃。根據搖瓶試驗獲得的優化條件在2 m3發酵罐中擴大培養，培養44 h，菌體濃度達3.9 ×109cfu/mL，芽胞濃度達 3.8×109cfu/mL，芽胞率97.4%。本試驗獲得芽胞數量、芽胞率均達到或高于上述研究報道水平，且經2 m3發酵罐擴大培養試驗驗證，效果良好，擴大培養高于搖瓶培養水平。此外，本試驗獲得的最佳培養條件，發酵主要原料為玉米淀粉、豆粕粉，營養要求比較低、來源廣、成本低，因此可進一步應用于工業化大規模生產。

巨大芽胞桿菌是1株很有潛力的生防菌株，已被越來越多地應用于農業生產中，本試驗僅對巨大芽胞桿菌JSSW-JD的產胞外酶特性進行了研究，下一步將深入研究其在植物病蟲害防治及土壤生態環境改善等方面的作用機理，如解磷作用和抑菌作用等。

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