乳酸桿菌與細菌性陰道病相關致病菌之間的關系

陳佳寧 呂 志 蘇建榮* 康熙雄

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心，北京100050;2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院實驗診斷中心，北京100050)

正常陰道菌群以乳酸桿菌為優勢菌，同時含有少量其他類型的厭氧菌等微生物［1］。陰道菌群維持著陰道微生態環境的平衡。

細菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)是一種菌群失衡的疾病狀態，其特征是陰道菌群中以乳酸桿菌為主的正常定植菌數量減少和(或)種類缺失，而以厭氧菌為主的條件致病菌占據了優勢菌的地位，從而導致了陰道微生態的失衡，容易引起一系列的合并癥，如早產、盆腔炎性反應甚至腫瘤等［2-3］。目前引起BV陰道菌群失衡的病因學機制尚未明確［4］，乳酸桿菌與其他條件致病性厭氧菌之間的關系仍有待深入研究。

陰道菌群中的大多數細菌為苛刻厭氧菌，難以進行常規培養和分離，只能利用分子生物學方法進行鑒定。本研究采用16S rRNA PCR方法對陰道菌群中的8種細菌進行檢測，包括正常陰道菌群中常見的3種乳酸桿菌:卷曲乳酸桿菌(lactobacillus crispatus，L.crispatus)、詹氏乳酸桿菌(lactobacillus jensenii，L.jensenii)和惰性乳酸桿菌(lactobacillus iners，L.iners);5種在BV陰道菌群中分離率較高的細菌［5］:包括陰道加德納菌(gardnerella vaginalis，G.vaginalis)、陰道阿托波菌(atopobium vaginae，A.vaginae)、普雷沃菌屬(prevotella sp)、纖毛菌屬(leptotrichia sp)和巨球菌屬(megasphaera sp)。對這8種細菌的分離率進行分析，研究陰道菌群中乳酸桿菌和BV相關條件致病菌之間以及致病菌和致病菌之間的關系，以加深對BV陰道菌群構成狀況的理解，為實驗室更準確地診斷BV奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

篩選170例18～45歲非妊娠期育齡婦女，研究對象均來自首都醫科大學附屬北京友誼醫院婦科門診和北京市房山區婦幼保健院門診，除外滴蟲、真菌等特異性陰道感染性疾病，除外梅毒等性傳播疾病。按照Amsel標準［1］和Nugent積分方法進行分組。符合Amsel標準、同時Nugent積分≥7的劃入BV組，共86例;不符合Amsel標準且Nugent評分為0～6分的劃入非BV組(對照組)，共84例。

Amsel標準:① 分泌物外觀稀薄、均勻黏附于陰道壁;② 陰道pH值＞4.7;③ 胺試驗陽性;④ 分泌物涂片中找到線索細胞。找到線索細胞為必備項目，同時需有其他任意2項陽性。

1.2 標本采集

無菌棉拭子在受檢者陰道壁下1/3處采集分泌物，放入無菌試管中立即送檢。

1.3 主要試劑和儀器

1)試劑:細菌基因組DNA試劑盒(美國OMEGA公司)，瓊脂糖(北京賽百盛基因技術有限公司，中國)。

2)儀器:ABI7300PCR分析儀(美國 ABI公司)，DYY-10C型電泳儀(北京六一儀器廠，中國)，Gel Doc 2000凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.4 細菌基因組DNA提取

棉拭子在PBS緩沖液中懸浮振蕩30 s，12 000 r/min離心5 min，取菌體沉淀按照DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。提取的總DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，－20℃保存。

1.5 細菌特異性16S rRNA PCR檢測及擴增產物分析

1)PCR:以樣本總DNA為模板，分別采用卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌、惰性乳酸桿菌、陰道加德納菌、陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬和巨球菌屬共8種細菌特異性引物擴增其中的16S rRNA片段。引物序列、PCR擴增片段長度及擴增條件見本課題組已發文章［5-6］。

2)產物分析:擴增產物在2%瓊脂糖凝膠(含0.15 mg/L溴化乙啶)中以100 V電壓電泳30～40 min，全自動凝膠圖像分析系統顯像觀察。符合片段大小的陽性擴增產物經切膠純化后由上海英俊生物技術有限公司進行DNA測序，并通過BLAST與Gene Bank比對。

1.6 統計學方法

數據用SPSS 11.5統計軟件進行分析。任意2種細菌之間的相關性利用χ2檢驗和Spearman等級相關系數(Spearman’s rank correlation coefficient，rs)進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義，相關性顯著。rs相關程度判斷標準:0.9～1.0，存在非常高的相關性;0.7 ～0.9，高度相關;0.5 ～0.7，中度相關;0.3 ～0.5，低度相關;0～0.3，微相關;0為無線性相關。3種及3種以上的細菌間相關性判斷利用Kendall和諧系數W進行W假設檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR檢測乳酸菌和BV相關細菌

卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌在非BV組的檢出率明顯高于BV組(P＜0.05)，而惰性乳酸桿菌在2組的檢出率比較，差異無統計學意義。陰道加德納菌、陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、巨球菌屬以及纖毛菌屬在BV組的檢出率明顯高于非BV組(P＜0.05)，詳見表1。

表1 乳酸桿菌和BV相關細菌在BV組及非BV組的PCR檢測結果Tab.1 Distribution of lactobacilli and bacterial vaginosis associated bacteria in women in non-BV and BV groups determined by PCR n(%)

2.2 卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌與惰性乳酸桿菌之間的關系

170位BV及非BV婦女中，卷曲乳酸桿菌的檢出率為51.2%(87/170)，詹氏乳酸桿菌為27.6%(47/170)，惰性乳酸桿菌為45.3%(77/170)。任意2種乳酸桿菌之間存在顯著的正相關性，相關程度為低度相關(表2)。對Kendall和諧系數進行W假設檢驗，結果說明3種乳酸桿菌之間也存在顯著的相關性(χ2=26.000，P ＜0.001)。

以卷曲乳酸桿菌為例，在檢出卷曲乳酸桿菌的標本中，詹氏乳酸桿菌和惰性乳酸桿菌的檢出率明顯升高，詳見表3。

表2 乳酸桿菌之間的Spearman等級相關系數(rs)Tab.2 Spearman’s rank correlation coefficient(rs)of lactobacillus

表3 卷曲乳酸桿菌存在和不存在時不同細菌的檢出率Tab.3 Prevalence of various bacteria according to the presence or absence of L.crispatus

2.3 BV相關致病菌之間的關系

陰道加德納菌、陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬、巨球菌屬在170名被檢婦女中的檢出率依次為52.9%(90/170)、31.8%(54/170)、43.5%(74/170)、22.4%(38/170)、17.1%(29/170)。陰道加德納菌與陰道阿托波菌(rs=0.415，P ＜0.05)、普雷沃菌屬(rs=0.210，P ＜0.05)以及纖毛菌屬(rs=0.273，P＜0.05)存在顯著的正相關關系(表4)，在陰道加德納菌存在的標本中，此3種細菌的檢出率明顯升高(表5)。巨球菌屬與陰道加德納菌沒有相關性(rs=0.107，P＞0.05)。陰道阿托波菌和其他4種 BV 相關細菌均具有顯著的正相關性，普雷沃菌屬和纖毛菌屬也是如此。陰道阿托波菌與陰道加德納菌、纖毛菌屬間為中等程度的正相關，其余存在相關性的任意2種BV相關致病菌間均為低度相關。Kendall和諧系數的W假設檢驗結果顯示5種BV相關致病菌之間存在顯著的相關性(χ2=87.612，P ＜ 0.001)，詳見表4。

表4 BV相關致病菌之間的Spearman等級相關系數(rs)Tab.4 Spearman’s rank correlation coefficient(rs)of BV-associated bacteria

表5 陰道加德納菌存在和不存在時BV相關細菌的檢出率Tab.5 Prevalence of BV-associated bacteria according to the presence or absence of G.vaginalis

2.4 乳酸桿菌與BV相關致病菌之間的關系

卷曲乳酸桿菌與普雷沃菌屬存在顯著的負相關性，而其他4種BV相關細菌的檢出率與卷曲乳酸桿菌無顯著關聯(表6)。惰性乳酸桿菌與陰道加德納菌呈顯著的負相關關系。普雷沃菌屬、巨球菌屬和纖毛菌屬的檢出率與惰性乳酸桿菌存在與否沒有顯著的關聯。詹氏乳酸桿菌與陰道加德納菌、陰道阿托波菌和纖毛菌屬呈負相關。普雷沃菌屬和巨球菌屬與詹氏乳酸桿菌沒有相關性。乳酸桿菌與對應有關聯的BV相關致病菌間相關程度均為低度。

Kendall和諧系數的W假設檢驗結果顯示乳酸桿菌與BV相關致病菌之間有顯著的負相關關系(χ2=99.142，P ＜0.001)。

表6 乳酸桿菌與BV相關致病菌間的Spearman等級相關分析Tab.6 Spearman’s rank correlation coefficient(rs)between lactobacilli and BV-associated bacterium

3 討論

細菌性陰道病是陰道菌群失衡的一種疾病狀態，正常優勢菌乳酸桿菌的比例下降或缺失、陰道加德納菌和其他厭氧菌的比例升高，陰道的正常微生態環境被破壞［7］。

正常陰道定植的乳酸桿菌種類很多，大量的研究［8-11］認為乳酸桿菌特別是產過氧化氫的乳酸桿菌在維持陰道自潔、抑制致病微生物過量繁殖中起著重要的作用。本研究選擇了卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌和惰性乳酸桿菌3種陰道常見乳酸桿菌［12-13］進行研究。Antonio等［14］報道，卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌產過氧化氫的能力最強。惰性乳酸桿菌是已知產過氧化氫較弱的乳酸桿菌。在現有的報道中，幾乎所有的卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌的菌株都可以產生過氧化氫，而惰性乳酸桿菌僅有約9%的菌株能夠產生過氧化氫［14-15］。

本研究中，卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌在非BV組的檢出率顯著高于BV組，而惰性乳酸桿菌在2組間的檢出率無顯著差別，與Tamrakar等［13］的報道相符。這也符合乳酸桿菌的產過氧化氫理論，即在BV時產過氧化氫能力強的卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌明顯減少，而產過氧化氫能力弱的惰性乳酸桿菌在BV陰道菌群與非BV陰道菌群中變化不明顯。

本研究顯示，卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌、惰性乳酸桿菌3種乳酸桿菌具有顯著的共存性。證明陰道菌群中乳酸桿菌是多種類并存的。

在本研究涉及的5種BV相關致病菌中，只有普雷沃菌屬與卷曲乳酸桿菌存在顯著的負相關關系，即在卷曲乳酸桿菌不存在的標本中，普雷沃菌屬的檢出率增高，陰道加德納菌等的檢出率和卷曲乳酸桿菌的存在與否并無明確關聯，這與卷曲乳酸桿菌的強產過氧化氫能力似乎不符。因為本研究是基于定性PCR檢測，不能反映檢測菌的量和比例關系，所以也可以推斷可能是陰道菌群中卷曲乳酸桿菌的量和比例關系決定了其對BV相關細菌的影響。

詹氏乳酸桿菌與陰道加德納菌、陰道阿托波菌和纖毛菌屬均存在顯著的負相關，證明這3種BV相關致病菌通常不與詹氏乳酸桿菌共存于陰道菌群中。說明詹氏乳酸桿菌的存在對陰道加德納菌、陰道阿托波菌和纖毛菌屬有明顯的負性影響，即可能會抑制這3種菌的生長。這與詹氏乳酸桿菌的強過氧化氫產生能力相符合。普雷沃菌屬、巨球菌屬與詹氏乳酸桿菌無明確關聯。

惰性乳酸桿菌與陰道加德納菌呈負相關，陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬和巨球菌屬的檢出率與惰性乳酸桿菌無明確關聯，這與Tamrakar等［15］的報道相反。Tamrakar等［15］研究認為惰性乳酸桿菌與BV相關細菌有共存關系。本文的結果表明惰性乳酸菌作為陰道正常定植乳酸菌的一種，與陰道加德納菌有顯著的“不共存性”，而與陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬和巨球菌屬之間也無明顯依存關系。這或可說明惰性乳酸桿菌對BV常見的致病菌陰道加德納菌具有一定的抑制作用，也可能惰性乳酸桿菌是通過與其他乳酸桿菌的共生來達到某種穩態以抑制陰道加德納菌的生長。而惰性乳酸桿菌與其他4種BV相關致病菌無顯著關聯性，這與其較弱的過氧化氫產生能力是相符的。

本研究對BV相關致病菌分析后發現，除陰道加德納菌與巨球菌屬無明顯關聯外，5種BV相關細菌之間均存在正相關關系。這證明BV陰道菌群是多種致病菌共存的復雜的生態環境，并非單一致病菌在起作用。本研究顯示陰道阿托波菌與陰道加德納菌、普雷沃菌屬和纖毛菌屬的共存關系較強，并且3種常見乳酸桿菌與5種BV相關致病菌之間存在顯著的負相關關系，即不共存性。由此可見，單獨對某一種BV相關細菌進行檢測不能對BV進行有效的診斷，更不能反映陰道菌群的真實情況。對具有顯著共存關系的BV相關細菌進行聯合測定，能夠給臨床提供更準確的診斷結果和更真實的陰道菌群構成情況。通過本研究可推斷聯合檢測陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬會為BV提供更準確的診斷。如果同時引入與BV相關細菌有顯著不共存關系的乳酸桿菌加入到上述聯合檢測中，也可能會有意想不到的良好效果。

［1］Srinivasan S，Fredricks D N.The human vaginal bacterial biota and bacterial vaginosis［J］.Interdiscip Perspect Infect Dis，2008，750479.Epub 2009 Feb 16.

［2］Pretorius C，Jagatt A，Lamont R F.The relationship between periodontal disease，bacterial vaginosis，and preterm birth［J］.J Perinat Med，2007，35(2):93-99.

［3］Livengood C H.Bacterial vaginosis:an overview for 2009［J］.Rev Obstet Gynecol，2009，2(1):28-37.

［4］Schwebke J R.New concepts in the etiology of bacterial vaginosis［J］.Curr Infect Dis Rep，2009，11(2):143-147.

［5］呂志，彭國麗，蘇建榮.細菌16S rRNA基因PCR診斷細菌性陰道病的研究［J］.首都醫科大學學報，2012，33(2):153-157.

［6］彭國麗，呂志，蘇建榮.熒光定量PCR比較不同季節婦女陰道主要乳酸桿菌的差異［J］.中國實驗診斷學，2010，14(2):236-239.

［7］White B A，Creedon D J，Nelson K E，et al.The vaginal microbiome in health and disease［J］.Trends Endocrinol Metab，2011，22(10):389-393.

［8］Kilic A O，Pavlova S I，Alpay S，et al.Comparative study of vaginal lactobacillus phages isolated from women in the United States and Turkey:prevalence，morphology，host range，and DNA homology［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2001，8(1):31-39.

［9］Zhou X，Bent S J，Schneider M G，et al.Characterization of vaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independent methods［J］.Microbiology，2004，150(Pt8):2565-2573.

［10］宋娟.12460例陰道分泌物檢驗結果分析P［J］.解放軍醫藥雜志，2011，23(5):46-48.

［11］李全桂，王英.陰道分泌物檢測754例結果分析［J］.臨床誤診誤治，2010，23(6):528-530.

［12］Fredricks D N，Fiedler T L，Marrazzo J M.Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis［J］.N Engl J Med，2005，353(18):1899-1911.

［13］Yan D H，Lü Z，Su J R.Comparison of main lactobacillus species between healthy women and women with bacterial vaginosis［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(22):2748-2751.

［14］Antonio M A D，Hawes S E，Hillier S L.The identification of vaginal Lactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics of women colonized by these species［J］.J Infect Dis，1999，180(6):1950-1956.

［15］Tamrakar R，Yamada T，Furuta I，et al.Association between Lactobacillus species and bacterial vaginosis-related bacteria，and bacterial vaginosis scores in pregnant Japanese women［J］.BMC Infect Dis，2007，7:128.