氘代同位素內標-氣相色譜-質譜法測定膽固醇含量鑒別地溝油的研究

許秀麗 任荷玲 李 娜 張鳳霞 王 磊 安 娟 仲維科

(中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100123)

1 前言

地溝油是人們對于生活中的各類劣質油的統稱，它主要包括三類:一是狹義的地溝油，即將下水道中的油膩漂浮物或者將賓館、酒樓的剩飯、剩菜(通稱泔水)經過簡單加工、提煉出的油;二是劣質豬肉、豬內臟、豬皮加工以及提煉后產出的油;三是用于油炸食品的油使用次數超過規定次數后，再被重復使用或往其中添加一些新油后重新使用的油。地溝油不僅對人體危害極大，而且影響國計民生甚至影響到國家的國際形象，地溝油事件已經成為媒體關注、百姓關心、領導憂心的重大問題。但是到目前為止，還沒有鑒別地溝油的有效方法。

本研究以地溝油生產的源頭為出發點，即根據餐飲業廢棄物中往往會含有大量的動物性成分，從中提取的地溝油不可避免地混有動物脂肪，也必定含有動物油脂的特征性甾醇——膽固醇。動植物組織中都含有甾醇，植物油中主要含有谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等多種植物甾醇，而一般不含或含有極少量的膽固醇。因此通過測定油中膽固醇的含量，即可判定植物油中是否含有動物油脂，從而推斷該油是否是地溝油或者混有地溝油。

目前，膽固醇測定常采用試劑盒［1］、生化分析儀［2］、熒光毛細分析法［3］、液相色譜法［4－6］、氣相色譜法［7－8］、氣相色譜質譜連用［9］、液相色譜質譜聯用［10］等方法。試劑盒、生化分析儀及熒光毛細分析法靈敏度較低，選擇性和特異性較差，不適于植物油中痕量膽固醇的含量分析。液相色譜和氣相色譜方法，尤其液相色譜－質譜/質譜和氣相色譜/質譜方法，靈敏度和特異性都比較高，但由于大多采用外標法，易受環境及儀器條件變化的影響進而影響準確度，同時其他同類甾醇類可能同時存在于植物油或地溝油基體中，導致方法的定量不準確。采用同位素內標法，可以較好的補償樣品預處理及檢測過程中諸多因素對檢測結果的影響。目前，尚無應用同位素內標法測定膽固醇含量鑒別地溝油的文獻報道。

本研究利用同位素內標稀釋－氣相色譜－質譜(GC－MS)聯用技術，建立了植物油及地溝油中膽固醇含量的精確分析方法，優化了前處理方法和色譜質譜條件，對比市售的108種各類植物油及公安部查封的23種地溝油中膽固醇的精確含量，發現地溝油與植物油的膽固醇含量差異。因此用膽固醇含量作為地溝油的一個衡量指標，將為地溝油的確證提供有效的依據。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

108種植物油:均為在北京各大超市購買，包括花生油、大豆油、玉米油、橄欖油、食用調和油、葵花籽油等;地溝油:20多種地溝油均為公安部門查封的地溝油廠家生產或已經勾兌好準備銷售的精煉地溝油;成品“地溝油”:經公安部門確認的已被犯罪分子在市場販賣的“地溝油”樣品;勾兌“地溝油”:實驗室采用經公安部門確認的純“地溝油”與陰性樣本按一定比例進行勾兌的樣本。實驗室配制的勾兌“地溝油”的梯度分別為:陰性樣本+50%純“地溝油”，陰性樣本+30%純“地溝油”，陰性樣本+20%純“地溝油”，陰性樣本+10%純“地溝油”以及陰性樣本+5%純“地溝油”。

2.1.2 試劑

膽固醇標準品和氘代膽固醇－D6內標:Sigma;其他試劑:國產分析純。

2.1.3 膽固醇標準溶液

準確稱取膽固醇標準品1.0 mg，用正己烷溶解制成100.0 mg/L標準儲備液，根據需要稀釋成適當濃度的加有1.0 mg/L膽固醇D6內標的標準工作溶液，于4℃下保存。

2.1.4 儀器

7890N氣相色譜－5975i質譜聯用儀:配有電子轟擊電離源(EI)和7683型自動進樣器，美國Agilent公司;12管防交叉污染SPE裝置:美國SUPELCO公司;MS2渦旋混合器:德國 IKA公司;N－1000VW旋轉蒸發儀:日本EYELA公司。

2.2 方法

2.2.1 樣品前處理

2.2.1.1 皂化法

2.2.1.1.1 皂化

稱取試樣0.5g(±0.01g)于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入10mL 2mol/L KOH－乙醇溶液，渦旋2min，振蕩10min，置于65℃恒溫振蕩水浴中皂化60min。

2.2.1.1.2 提取

向離心管中加入飽和NaCl水溶液4mL、正己烷10mL，振蕩提取10min，于10000 rpm 離心3 min。吸取上層清液于50mL聚四氟乙烯離心管A中。再加入正己烷10mL，重復提取1次。合并上清液于50mL聚四氟乙烯離心管A中，加入2%Na2SO4水溶液10mL，渦旋2min，10000 rpm 離心3 min，上層有機相過無水Na2SO4后轉移至梨形瓶中，并濃縮至近干，用正己烷定容至2mL，待GC/MS檢測。

2.2.1.2 SPE 法

2.2.1.2.1 樣品準備/提取

稱取試樣0.5 g(±0.01 g)于10mL具塞比色管中，用5mL正己烷溶解，作為上樣溶液待凈化。

2.2.1.2.2 SPE 柱凈化

(1)活化:加入10 mL正己烷，棄去流出液;(2)上樣:加入待凈化液，棄去流出液;

(3)淋洗:加入10 mL 5%乙醚－正己烷(V/V)，棄去流出液;

(4)洗脫:加入15 mL 10% 乙醚－正己烷(V/V)，收集流出液，于40℃減壓蒸干，用正己烷定容至1mL，待GC/MS檢測。

2.2.2 GC/MS 測定條件

2.2.2.1 色譜條件

色譜柱:DB－5MS石英毛細柱(30m×0.25mm×0.25μm);進樣口溫度:280℃;不分流進樣模式，不分流時間:1.00 min;升溫程序:初始溫度220℃，保持2 min，以30℃/min升至280℃，保持12 min;載氣(He)流速:l.2 mL/min。

2.2.2.2 質譜條件

EI電離方式，電子能量 70eV;離子源溫度250℃;電子倍增器電壓1605 V;質量掃描范圍M/Z 190－450;傳輸線溫度為270℃。選擇離子(SIM)方式時:氘代膽固醇內標:M/Z 392，377，355;膽固醇:M/Z 386，368，301，213。

3 結果與討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

采用皂化和固相萃取(SPE)兩種方法對植物油與地溝油中的膽固醇進行提取，兩種方法的測定結果基本一致。但SPE法的干擾色譜峰明顯少于皂化法，見圖1和圖2，研究表明SPE去除基質干擾更充分。同時具有操作更加簡單、回收率更穩定的特點。因此，采用SPE法處理樣品。

圖1 皂化法的D12號地溝油樣品選擇離子譜圖

圖2 SPE前處理方法的D12號地溝油樣品選擇離子譜圖

3.2 方法評價

在實驗中利用氣相色譜－質譜技術，分別采用內標法和外標法對植物油樣品中膽固醇進行回收率比較。結果表明，使用外標法時其回收率為70.5% －91.6%，平均回收率為82.1%，而用內標法定量時，其回收率為93.5% －99.5%，平均回收率為 96.0%;內標法的定量回收率略高于外標法;外標法最低檢出限為0.5mg/kg，與內標法的0.2 mg/kg 相比，稍有差別，這主要是由于外標法抗環境與儀器檢測條件變化能力不如內標法所致;外標法的線性范圍為0.5 －50.0 mg/kg，與內標法的0.2 －20.0 mg/kg 相比，主要是由于檢出限的差異引起的線性范圍低限的差別?？傮w而言，同位素內標法比外標法具有更好的準確性。

本實驗采用內標標準曲線法定量。配置濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L 膽固醇標準溶液，其中每份內含1.0 mg/L膽固醇－D6內標溶液。GC/MS/SIM測定后，以膽固醇與內標物的膽固醇定量離子峰面積比值為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標做圖，得到內標標準工作曲線。結果表明，膽固醇在0.1－10.0 mg/L范圍內線性關系良好，線性方程為，相關系數為0.9998。

3.3 植物油中膽固醇含量對比分析

按上述建立的實驗方法，對108種市場購買來的品牌植物油進行了膽固醇含量對比。每個樣品平行前處理3次，膽固醇－D6內標法定量，結果見表1。

表1 108種植物油膽固醇測定平均值及穩定性RSD(n=3)

(續表)

(續表)

表1顯示，每種植物油的膽固醇值含量差別不大，例如12種花生油膽固醇值在1.49－2.98 mg/kg，7 種大豆油的膽固醇含量在 5.36 －11.65 mg/kg，普遍高于花生油。但總結108種市售植物油的膽固醇值可得出，除2種亞麻籽油和2種菜籽油膽固醇值較高，在19.41－28.26 mg/kg的水平，其余包括深海魚油調和油(膽固醇值為12.76 mg/kg)在內的97種食用油的膽固醇值均低于15.0 mg/kg，且絕大多數食用油的膽固醇值低于10.0 mg/kg。

3.4 地溝油中膽固醇含量分析

各地公安部門查獲的地溝油共23種，按以上建立的方法測定膽固醇含量，見表2。

表2 地溝油中膽固醇平均含量及測定相對標準偏差(n=3)

D14 地溝油 14 204.67 4.65 D15 地溝油 15 241.70 0.56 D16 地溝油 16 190.43 1.24 D17 地溝油 17 8.22 6.32 D18 地溝油 18 86.42 5.26 D19 地溝油 19 8.11 3.21 D20 地溝油 20 7.58 5.32 D21 地溝油 21 33.63 4.28 D22 地溝油 22 41.43 5.09 D23 地溝油23 36.83 2.45

從表2可見，23種地溝油中除D17、D19和D20三種地溝油外，膽固醇含量均在24.0 mg/kg以上，甚至高達599.30 mg/kg，是108種植物油的幾十至上百倍。根據膽固醇含量的測定值，可以明確判定其為地溝油。3種膽固醇含量較低的地溝油為貼好標簽準備市售的精煉地溝油，其標簽明確標識為某品牌“花生油”標簽，但根據對植物油的對比結果，花生油的膽固醇值含量極低，在1.49－2.98 mg/kg，而3種地溝油的膽固醇含量值則分別為8.22、8.11和7.58 mg/kg，為測定值的 4倍。據此，可以懷疑此“花生油”可疑，應為勾兌地溝油。

3.5 典型植物油和地溝油中膽固醇檢出標準譜圖見圖4和圖5。

3.6 地溝油與植物油不同勾兌比例時的膽固醇測定含量

圖4 地溝油樣品中膽固醇標準譜圖(12.22min為膽固醇)

圖5 植物油樣品中膽固醇的標準譜圖(12.20 min為膽固醇)

D12號格林地溝油為從地溝油加工生產企業直接取回的典型地溝油，顏色清亮，外觀與普通食用植物油差異不大。為了測定地溝油與植物油不同勾兌比例時的膽固醇含量，選擇D12號格林地溝油與1號植物油(壓榨1級花生油)不同勾兌比例進行測定。地溝油所占比例分別為50%、30%、20%、10%和5%，理論計算值與實際測定值見表3。從表3中可見，實際測定值與理論計算值基本相當。圖6給出了地溝油勾兌含量為50%、20%和10%時膽固醇檢測譜圖，從圖中可以看出地溝油含量不同時，膽固醇含量呈梯度變化。同時可以看出，在地溝油勾兌比例為5%時，測定值8.85 mg/kg，相當于D19和D20“花生地溝油”的膽固醇水平，是測定花生油樣品中膽固醇含量的4倍。因此該檢測方法目前可檢測到典型地溝油勾兌到5%的水平。

表3 D12號地溝油與1號植物油不同勾兌比例時的測定值與理論值

G3 勾兌20%地溝油D14 30.51 29.53 G4 勾兌30%地溝油D15 42.91 43.16 G5 勾兌50%地溝油D16 70.90 70.42 D12 格林地溝油138.56 /

4 結論

利用建立的SPE－氘代同位素內標－GC/MS檢測方法，對比了108種市售品牌植物油與23種地溝油樣品中膽固醇含量，結果顯示地溝油中膽固醇含量是植物油中含量的幾十到幾百倍，表明利用膽固醇含量檢測方法，可明確判別地溝油加工廠生產的地溝油。

同時，發現同一種類植物油樣品中膽固醇含量差別不大。通過對不同比例勾兌地溝油(比例分別為50%、30%、20%、10%和5%)的結果顯示，勾兌5%地溝油的花生油樣品中膽固醇含量仍高于市售花生油樣品中膽固醇含量的4倍，可判定其為勾兌的地溝油樣品。

應用該鑒別地溝油方法，參加了兩次衛生部組織的盲樣考核，陰性準確率分別為89%和60%，陽性準確率分別為93%和91%。表明該檢測方法可以作為地溝油鑒別方法之一，有助于解決當前棘手的地溝油檢測難題。

圖6 地溝油勾兌含量為50%，20%和10%時膽固醇檢測譜圖

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