2種靈芝液體培養的比較研究

蔡愛群，余明練

(韶關學院英東生命科學學院，廣東 韶關 512005)

赤芝（Ganoderma lucidum)和松杉靈芝（Ganoderma tsugae）均屬擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝菌屬。有關學者發現赤靈芝多糖可減輕動脈粥樣硬化風險，降低血脂。鄭克巖等人通過小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠睪丸染色體畸變和Ames試驗觀察了松杉靈芝多糖的抗突變作用[1]。大量實驗證明，靈芝多糖具有提高人體免疫能力、抗癌、抗病毒、護肝、延緩衰老、防止慢性支氣管炎和鎮靜止痛等功效。

由于靈芝多糖的藥用價值高，近年來，靈芝多糖暢銷于東南亞各國、臺灣和香港等地。市場需求量日趨增加，供求關系緊張。子實體和菌絲體在藥用價值方面相同，由于子實體生產周期長，受氣候影響大，影響產量及質量，通過液體培養菌絲體取代人工栽培子實體，大大縮短生產周期，提高靈芝多糖的生產能力。對解決資源匱乏、滿足市場需要、提高經濟效益，均具有十分重要的意義。

在靈芝多糖含量研究方法方面近幾年一直都有報道。于浩瀚等[2]對靈芝深層發酵菌絲體多糖含量的測定，結果表明以超聲波破壁處理后，再以熱水浸提法提取，多糖得率可以明顯提高。多糖含量的測定方法，前人學者研究了苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法、3，5－二硝基水楊酸法、Fehling滴定法、碘量法、高效液相色譜法等多種測定方法。趙陽楠[3]等研究了苯酚硫酸法和間接碘量法測定靈芝多糖含量比較，結果顯示測定總糖的結果基本一致，均不需要精密儀器，操作簡便，穩定可靠。通過前人的研究總結，多糖含量測定的方法基本成熟，只是在具體實驗操作中可根據不同的實驗目的和實驗條件選擇合適的方法。

近年來，國內外許多學者都集中于研究赤芝和松杉靈芝液體培養營養需求和多糖提取測定的研究。例如，泰山赤靈芝液體培養條件優化及多糖含量測定[4]，松杉靈芝發酵菌絲體中水溶多糖的分離純化與結構的比較研究[5]。但眾多的研究都是單一地對赤芝或者是松杉靈芝來研究測定，還沒有對它們進行比較探究。本試驗通過在相同的液體培養條件下，對赤芝和松杉靈芝的多糖含量得率進行比較，旨為發酵培養工廠化研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

赤芝、松杉靈芝菌種：韶關學院英東生命科學學院微生物學實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑

去皮馬鈴薯、KH2PO4、MgS04·7H2O、瓊脂、葡萄糖、0.1%蒽酮－硫酸、95%乙醇、蒸餾水。

蒽酮試劑：稱取0.1g蒽酮，溶于80%濃硫酸（將98%濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中）100 mL，冷卻至室溫，儲存于棕色瓶內，冰箱保存，現配現用。

1.1.3 儀器設備

三角瓶、紗布、容量瓶、圓底燒瓶、研磨缽、10 mL離心管、超凈工作臺、可調速旋轉式搖床、電子天平、高速離心機、可見光分光光度計，水浴鍋等。

1.1.4 培養基

種子培養基：PDA培養基。

取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液定容至1 000 mL，加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，0.1 MPa滅菌30 min，擺斜面。（不加瓊脂就是種子液體培養基）。

液體培養基：在PDA培養基中加KH2PO43 g、MgS04·7H2O 1.5 g（不加瓊脂）

1.2 方法

1.2.1 菌種活化[6]

將保存的赤芝和松杉靈芝菌種接種到斜面培養基上，28℃培養 7 d。

1.2.2 菌絲體液體培養與收集

取約0.5 cm2大小的活化菌種轉接于裝有100 mL種子液體培養基的250 mL三角瓶中，每瓶接種3塊～4塊，28℃，150 r·min－1，振蕩培養 6 d。 將大約 10 mL 種子培養液分別接入 100 mL培養基中，28℃，150 r·min－1振蕩培養4 d。用3層紗布將發酵液過濾，蒸餾水洗滌3次，將菌絲體收集60℃烘干至恒重，研磨成菌粉備用。2種供試菌種均設2次重復，每次重復中赤芝和松杉靈芝各培養5瓶[2,6]。

1.2.3 菌絲體生物量的測定

稱量以上備用菌粉，精確到0.01 g。計算公式[7]：

1.2.4 赤芝和松杉靈芝多糖的提取

分別稱取赤芝和松杉靈芝菌粉約0.3 g，至于圓底燒瓶中加水50 mL沸水浴中浸提2 h，放冷至室溫，轉移至100 mL容量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一容量瓶，加水至刻度，搖勻，過濾，精密量取濾液2 mL分別裝于3支10 mL離心管中，按1∶4比例每支離心管加95%乙醇8 mL，搖勻，至于冰箱中冷藏過夜。次日取出，4 000 r·min－1離心20 min，棄上清液，沉淀加75%乙醇，洗滌2次，沉淀加熱水溶解，轉移至25 mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，作為待測溶液[8]。

1.2.5 赤芝和松杉靈芝多糖含量的測定：蒽酮－硫酸法[3,9]

（1）葡萄糖標準曲線的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水適量使溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 mL置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。即得到濃度為 100 μg·mL－1葡萄糖對照品溶液。

取6支10 mL具塞試管，從0～5編號，按表1分別加入各試劑。

將各管快速搖動混勻后，放在沸水浴中15 min，取出冷卻，在625 nm波長下，用空白調零測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖濃度（C）（μg·mL－1）為橫坐標繪制標準曲線，得一不過原點的直線。葡萄糖的濃度在 20 μg·mL－1～100 μg·mL－1范圍內與吸光度呈良好的線性關系，見圖1?；貧w方程為A=0.0062C+0.0264，r=0.9982。

表1 蒽酮-硫酸法測多糖制作標準曲線的試劑量及測定結果

圖1 葡萄糖標準曲線

（2）赤芝和松杉靈芝待測溶液多糖含量的測定

分別精密吸取1.2.4所得的待測溶液1 mL，置于10 mL具塞試管中，加入5 mL蒽酮試劑，照標準曲線制備項下的方法，依法測定吸光度（A）。由回歸方程計算待測溶液中葡萄糖濃度（C），按照下式計算赤芝和松杉靈芝多糖含量[10]。

式中：W為多糖含量（%）；C為待測溶液中葡萄糖濃度（μg·mL－1）； f為待測溶液稀釋倍數； V 為樣品定容體積；m為樣品的質量（μg）。

2 結果與分析

2.1 赤芝和松杉靈芝液體培養菌絲體生長比較

在重復Ⅰ和重復Ⅱ的培養中，從肉眼觀察，赤芝菌絲體生長速度快，松杉靈芝菌絲體生長速度較慢，而且赤芝菌絲球體積比松杉靈芝菌絲球要大。以獲取菌絲體為目標則可首選赤芝，其生長速度快但衰老和自溶速度也快，因此要把握其發酵時間。對液體培養的菌絲體干重進行測定，測定結果如表2。

表2 赤芝和松杉靈芝菌絲體干重比較

從表2得知，赤芝菌絲體干重平均值為0.640 g·100－1·mL－1，松杉靈芝菌絲體干重平均值為 0.426 g·100－1·mL－1。測定結果表明，液體培養的菌絲體干重赤芝也比松杉靈芝高。

2.2 赤芝和松杉靈芝多糖含量比較

不同菌株生物活性多糖的含量由于菌種特性、培養條件的不同存在差異[2]。在相同的培養基、相同的培養溫度、轉速、時間，對赤芝和松杉靈芝進行液體培養，并用相同的提取方法提取多糖，對它們的菌絲體多糖含量進行測定。測得數據如表3、表4。

從表3、表4得知，兩種菌株在兩批的液體培養中，赤芝多糖含量平均值為7.22%，松杉靈芝多糖含量平均值為3.78%。測定結果表明，赤芝菌絲體多糖含量比松杉靈芝高。

表3 赤芝菌絲體多糖含量

表4松杉靈芝菌絲體多糖含量

綜上所述，本試驗通過在相同的培養條件對赤芝和松杉靈芝，采用蒽酮－硫酸法測定它們的多糖含量，得出的結果是液體培養的菌絲體生長速度赤芝比松杉靈芝快，多糖含量也比松杉靈芝高，因此赤芝更適合用于液體培養生產靈芝多糖。

3 討論

3.1 培養條件的選擇

在赤芝和松杉靈芝液體培養中選擇最普通的加富PDA培養基，減少了兩種靈芝生長營養成分的差異。由于赤芝生長速度快自溶速度也快，所以要控制好培養時間，要在赤芝未發生自溶之前就要將兩種靈芝的菌絲體收集。

3.2 提取方法

不同的提取方法對靈芝菌絲體中多糖的提取率不同[8]。本法采用沸水浴提取，提取時間確定為2 h，然后用乙醇醇析過夜，對赤芝和松杉靈芝多糖提取率均屬正常，該法操作簡易，切實可行。今后可研究赤芝和松杉靈芝最佳的提取時間：延長提取時間或者進行多次提??；乙醇醇析的時間可以根據試驗的需要，延長或者縮短來達到最好的提取效果。

3.3 測定的方法

多糖含量測定的方法有很多，但是常用的多數是苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法、間接碘量法等。通過前人學者的研究，證明測定多糖的方法對多糖含量的影響不大，結果基本一致。但是如果是操作上的誤差，就會對試驗結果造成很大影響。由于苯酚容易氧化，見光或遇氧即氧化成淡紅色，對顯色有干擾。間接碘量法中要加硫代硫酸鈉，由于它具不穩定性，而且堿容易影響碘揮發，會使測定產生誤差。蒽酮－硫酸法中蒽酮都會受光和氧的影響對顯色有干擾，蒽酮是溶于硫酸中。苯酚－硫酸法中，是先加苯酚再加硫酸，多次滴加試劑，容易造成劑量的誤差[3]。蒽酮硫酸法使用起來比較方便，涉及的藥品比較少，避免了藥品不穩定性產生的誤差，操作容易。

3.4 菌絲體產量的比較

從2.1測定的結果來看，赤靈菌絲體產量比松杉靈芝高，這可能是菌株自身的生物特征影響著其產量，就從肉眼觀察就可以粗略地判斷赤芝和松杉靈芝菌絲體產量高低，赤芝菌球體體積明顯比松杉靈芝大，而且生長密集，所以以獲取菌絲體為目標，優先選擇赤芝。

3.5 多糖含量和測定方法比較

從2.2測定的結果來看，重復Ⅰ中赤芝和松杉靈芝多糖含量都比重復Ⅱ高，產生的原因可能是菌絲體開始發生自溶現象使多糖含量降低，又或者是測定時操作上產生的誤差。從兩次的培養中赤芝多糖含量明顯比松杉靈芝多糖含量要高，因此以生產靈芝多糖為前提，赤芝是優先選擇的菌株。試驗結果看得出赤芝多糖含量比松杉靈芝多糖含量高，產生這結果的原因有：靈芝菌株特有的生物特性決定了它本身的有效成分的高低，可能是松杉靈芝多糖含量比較低，其它有效成分比較高，分配比例不同；培養條件也影響著結果，有可能是培養基還沒有達到兩種靈芝的最佳營養需求，如培養溫度、時間還沒有調節好，也有可能影響結果。

3.6 存在問題及解決方法

液體培養時，菌絲體要與空氣充分接觸，進行氧氣交換，用瓶塞由于封閉太密，空氣得不到充分流通，菌絲體生長受到抑制，影響生長速度。為了達到充分氧氣交換，改用8層紗布和2層報紙蓋住三角瓶口。

在試驗的液體培養過程中，發現赤芝菌絲體生長速度比松杉靈芝快，而且菌絲球體大，很快就長滿三角瓶。此試驗要求在相同的培養條件下，即培養時間也相同，所以選擇收集菌絲體的時間是一個關鍵，在確保赤芝菌絲體還未發生自溶的前提下，同一時間收集成熟的松杉靈芝菌絲體。

在烘干過程中，如果時間過長，菌絲體就會發生自溶影響多糖的含量，因此為了盡快將其烘干，將菌絲體分裝在多個容器里烘干至恒重。

本試驗是采用熱水浸提法提取多糖、蒽酮－硫酸法測定多糖，由于提取的方法會影響多糖含量，所以可以進一步嘗試用其它方法來提取后，再蒽酮－硫酸法測定赤芝和松杉靈芝多糖含量進行比較研究。

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[2]于浩瀚，謝林，肖深根，等.靈芝深層發酵菌絲體多糖含量測定[J].中藥材.2007，30（9）：1061－1063.

[3]趙陽楠，常繼東.苯酚硫酸法和間接碘量法測定靈芝多糖含量比較[J].食用菌學報，2007（3）：59－61.

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[5]梁忠巖，張翼伸，苗春艷.松杉靈芝發酵菌絲體中水溶多糖的分離純化與結構的比較研究[J].真菌學報，1994，13（3）：211－214.

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