鎖陽多糖CSP-D1的分離純化與表征

王風霞，張繼，，*，高義霞，王云普

（1.天水師范學院生命科學與化學學院，天水市農產品深加工工程技術研究中心，甘肅 天水 741001；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070）

鎖陽（Cynomorium songaricum Rupr.）是多年生草本植物鎖陽的肉質莖，喜生于荒漠草原帶與荒漠帶的干旱或含鹽堿的沙地上，常寄生于白刺的的根部。鎖陽具有補腎陽、益精血、潤腸通便[1]和提高免疫力[2]的功效，在民間常作為食物蒸食，也作為補藥廣泛使用。研究發現多糖類物質有可能是鎖陽重要的有效成分[3]。近年來，盡管鎖陽逐漸受到了醫藥界的廣泛關注，但與其他的植物多糖相比，鎖陽多糖的研究并不廣泛?，F有的研究也多以粗糖的提取工藝[4-5]、藥理活性[6-8]為主，對鎖陽多糖結構[9-10]的研究報道極少。本工作從具有抗氧化活性的鎖陽多糖復合物中分離出2個多糖組分，本文僅對其中得到的新的可溶性多糖（Polysaccharide isolated from Cynomorium songaricum Rupr.，CSP-D1）的理化性質、單糖組成等的研究進行報道，為鎖陽藥用資源的研究開發及植物多糖的研究應用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖陽購自甘肅省黃河藥材市場。DEAE-纖維素柱填料為 Cellulose DE-52（solarbio）；木瓜蛋白酶（sigma）、各種標準單糖、D-半乳糖醛酸（sigma）、H2O2、CHCl3、正丁醇、咔唑、乙酸酐、吡啶等其他試劑均為分析純：天津化學試劑一廠。

1.2 儀器與設備

HL-2恒流泵、BSZ-100自動收集器：上海青浦滬西儀器廠；GPC2000高溫凝膠滲透色譜儀：美國waters公司；FTS3000型傅里葉紅外光譜儀：美國PE公司；GC-MS 聯用儀[配有 HP-5（30 m×0.25 mm×0.25μm）彈性石英毛細管柱及美國NIST02L質譜數據庫]：美國安捷倫公司；UV1100紫外分光光度計：北京萊伯泰科科技有限公司；DT-40 TG-DTA熱分析系統：日本島津。

1.3 方法

1.3.1 鎖陽多糖CSP-D1的分離純化

鎖陽多糖的提?。烘i陽低溫真空烘干后，粉碎，100目過篩。70%乙醇浸泡粉末除脂，熱水浸提，濾液濃縮后乙醇沉淀，離心收集沉淀，冷凍干燥得鎖陽粗多糖。粗多糖用木瓜蛋白酶和sevag法[11-12]脫蛋白，H2O2法脫色[9]得到鎖陽精多糖。

鎖陽多糖CSP-D1的純化[13]（采用DEAE-纖維素柱純化）：100 g Cellulose DE-52，蒸餾水浸泡，再用0.5 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCl溶液處理30 min，抽干后用蒸餾水洗滌至中性。用磷酸緩沖液處理后裝柱（1.6 cm×51 cm）。分別用蒸餾水及0～0.2 mol/L的NaOH進行梯度洗脫，恒流泵控制流速為0.6 mL/min，自動收集器收集，每管收集8 min，隔管苯酚硫酸法于A490檢測糖分布。

1.3.2 GPC（高溫凝膠滲透色譜）純度檢測

測定條件為 Laser wavelength：690.0 nm；Solvent：water；Flow rate：0.500 mL/min。

1.3.3 紅外吸收光譜的測定

樣品KBr壓片處理，于400 nm-1～4000 nm-1波長掃描。

1.3.4 GC-MS（氣相-質譜法聯用）測定單糖組成

色譜柱：HP-5彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：160 ℃保持 3 min，以 2 ℃/min 程序升溫升至210℃，保持1 min；檢測器溫度：250℃；進樣口溫度：250℃；載氣（N2）流速 1.0 mL/min，進樣量0.2μL；分流比：50 mL/min。

完全酸水解及衍生化[14]：10 mg多糖加入4 mol/L三乙氟酸（TFA）4 mL，120℃氮氣保護反應 10 h，產物蒸干后加入40 mg鹽酸羥銨，2 mL吡啶，90℃反應30 min得到乙?；a物。標準單糖同樣做衍生化處理。減壓蒸干乙?；a物，氯仿溶解后進行GC-MS分析，并根據氣質各峰的面積比算出百分含量。

1.3.5 TG-DTA（差熱-熱重）分析

取CSP-D1粉末2 mg左右，參比物為Al2O3，氣氛為氮氣，升溫速率：10℃/min，升溫范圍：25℃～750℃。

1.3.6 糖醛酸含量的測定

糖醛酸含量的測定[14]：以半乳糖醛酸為對照品制作標準曲線（溶液濃度范圍為 10μg/mL～100μg/mL），采用咔唑法，依照文獻處理后使用紫外分光光度計在400 nm～800 nm掃描（以蒸餾水同法操作為參比）得最佳波長為526 nm。取CSP-D1溶液0.1 mL，同時做3個重復，按標準曲線的測定法分別測定其吸光值，并利用線性回歸方程計算糖醛酸含量。

2 結果與分析

2.1 鎖陽多糖CSP-D1的純度分析

鎖陽多糖經過 Cellulose DE-52（1.6×51 cm）柱層析，用苯酚硫酸法測定洗脫曲線如圖1。

圖1 鎖陽多糖Cellulose DE-52纖維素柱洗脫曲線Fig.1 Chromatogram of Cynomorium songaricum Rupr.polysaccharide on Cellulose DE-52

由圖1可知，用蒸餾水洗脫時可得1種組分，NaOH進行梯度洗脫得另一組分。峰一收集得到的鎖陽多糖命名為CSP-D1，此組分峰形對稱。峰二的峰形較峰一偏斜程度大，本文僅做峰一的研究。

CSP-D1干燥后粉末為淺黃色，易溶于水，如圖2，GPC測得其分子量（Mn）為5.5×104。從GPC激光檢測得到的響應曲線可見其峰形對稱，表明組分均一。

2.2 鎖陽多糖CSP-D1的結構表征

圖3為CSP-D1的紅外光譜圖。

圖2 CSP-D1的GPC檢測（激光檢測器）Fig.2 Gel permeation chromatogram(measured with laser detector)of CSP-D1

圖3 CSP-D1的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of CSP-D1

3398.57cm-1的-OH 吸收峰，2932.25 cm-1的C-H伸縮振動峰以及1400 cm-1～1200 cm-1左右的C-H變角振動峰都是糖類化合物的特征吸收峰[11]；1615.77 cm-1～1442.09 cm-1處的吸收峰為C=O振動峰和C-H彎曲振動峰；875 cm-1為β-D吡喃葡萄糖的特征吸收峰[16-17]。

以常見的8種標準單糖做對照，以逐一進樣與混合進樣的方法，確定每種單糖的出峰時間，得到GCMS單糖標準圖譜，如圖4。圖5為CSP-D1的GC-MS圖譜，根據各色譜峰與標準樣品保留時間的對照見表1。

表1 GC-MS測定標準單糖與CSP-D1單糖組成的保留時間及含量Table 1 GC-MS analysis of the retention time and content of standards and CSP-D1

由以上圖表可知，CSP－D1的色譜峰依次為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。各組成含量表明，其主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖組成，并含有少量的鼠李糖。其中保留時間為11.14 min的峰經GC-MS數據庫檢索由非糖物質形成，此峰在標準糖圖譜中同樣存在。與已有的文獻報道[9]不同，鎖陽多糖單糖組成中并不含核糖，此外，含量最多的不是半乳糖而是葡萄糖。推測以上結果差異是由以下原因造成的：1）材料、提取純化以及測定方法的差異都可能導致文獻與本研究中的鎖陽多糖為結構不同的糖；2）文獻中的核糖是含量最少的組分，其存在與否與多糖純度及儀器的靈敏度緊密相關，即使材料中存在少量核酸，都有可能在單糖組成分析時出現核糖。

圖6（A、B）中分別為CSP-D1的DTA以及TG曲線。

由圖6A可知，CSP-D1的分解反應[18]主要集中在290℃～520℃，分多步發生。100℃以下的失重由吸附水分的蒸發引起，之后的失重為多糖本身的分解。其結果分析見表2、3。從圖6B可知，CSP-D1的起始分解溫度為206.9℃，外推始點277.8℃。

圖4 標準單糖的GC-MS圖譜Fig.4 GC-MS spectra of Standards

圖5 CSP-D1單糖組成的GC-MS圖譜Fig.5 GC-MS spectra of monosaccharide composition of CSP-D1

表2 CSP-D1差熱分析表Table 2 The differential thermal date of CSP-D1

表3 CSP-D1熱重分析表Table 3 The initial decomposition temperature and weight loss of CSP-D1 and CSP-D1

2.3 鎖陽多糖CSP-D1糖醛酸含量的確定

按照1.3.5方法，對樣品中糖醛酸含量進行測定，得出CSP-D1中的糖醛酸含量為27.9%，與文獻中[7]報道的兩種鎖陽多糖的糖醛酸含量相比，平均高出了17.3%。

3 結論

1）鎖陽經水提醇沉分離、脫蛋白脫色后，柱層析可以得到組分均一，分子量為5.5×104的CSP-D1多糖。2）鎖陽多糖CSP-D1是含糖醛酸（其糖醛酸種類目前還不確定）27.9%的酸性雜多糖，其單糖組成為：鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其中含量最多的糖為葡萄糖，其次為半乳糖。百分含量分別為44.26%和23.30%。紅外光譜證實其具有多糖類特征吸收峰，單糖連接方式中存在β連接，熱分析表明CSP-D1為無定形粉末。3）綜合以上結果，CSP-D1是鎖陽中提取得到的一種新的多糖，與已經發現的鎖陽多糖相比，其單糖組成相對單一，并且具有較高的糖醛酸含量，該糖與已發現的鎖陽多糖不同的結構對應的藥理優勢還有待進一步研究。

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