響應面法優化黑豆皮花色苷提取工藝的研究

盧春曉，吳朝霞，*，徐亞平，張璇，何思，許瀟涵

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.朝陽工程技術學校食品學院，遼寧 朝陽 122000）

黑豆（Semen glycine）又稱櫓豆、料豆、零烏豆，是虎耳草科小灌木，全國各地均有栽培，是一種黑色皮的特殊大豆品種。黑豆不僅富含豐富的營養元素，而且還有一定的功能性成分[1]。在中國民間，“醋泡黑豆”是一種經過實踐的驗證獲得了廣泛認可的保健食品資源，具有軟化血管、改善心血管系統功能、降血壓、止咳、補腎益氣等功效[2]，但其功效成分的組成、生理功效和劑量-效應關系等問題還未能經過科學的、嚴謹的實驗驗證[3]。采用乙酸超聲波法提取黑豆皮中花色苷[4]，在單因素基礎上采用響應面分析方法進行參數優化[5]，以期為黑豆皮色素的深入研究、開發新保健食品資源及發展食療養生提供必要的參考。

1 儀器、材料與試劑

1.1 材料與試劑

烏皮黃仁黑豆：沈陽新帝食品有限公司提供。

1.2 儀器

VIS-7220G型分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；PHS-25數顯pH計：上海雷磁精密儀器廠；電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-6型數顯恒溫水?。簢A電器有限公司；KQ-100DB型數控超聲波清洗器；RE-52型旋轉蒸發儀：上海博通儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的預處理

將黑豆人工剝皮，將皮烘干至恒重，粉碎，過40目篩后備用。

1.3.2 黑豆皮色素吸收峰的測定

稱取0.5 g黑豆皮粉和3.5%乙酸水溶液50 mL，混合后于60℃水浴浸提30 min，將浸提液過濾，稀釋到適當濃度，用分光光度計進行光譜掃描[6]，測其特征吸收光譜。

1.3.3 黑豆皮提取液中的色素測定[7]

從1.3.2中制備的待測液中吸取1.0 mL，用pH 1.0的HCl-KCl緩沖溶液定容至10 mL，以HCl-KCl緩沖溶液為參比液，在最大吸收波長512 nm處測定吸光值，以吸光值等于1為1個花色苷單位。多次浸提黑豆皮，直至浸提液無色，分別收集各次色素提取液，合并各次提取液，得到總體積（%）和總吸光度值。

1.4 黑豆皮中花色苷的超聲波萃取法提取工藝的研究

1.4.1 黑豆皮中花色苷超聲波法單因素試驗

1.4.1.1 超聲波功率對黑豆皮花色苷提取效果的影響

在液料比10∶1，乙酸濃度10%，提取25℃，20 min條件下，研究超聲波頻率分別為 60、70、80、90、100 W時對黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.2 溶劑提取濃度對黑豆皮花色苷提取效果的影響

在液料比 10∶1，提取溫度 25 ℃，提取 45 min，研究乙酸濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%時對黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.3 提取液料比對黑豆皮花色苷提取效果的確定

在乙酸濃度為30%，提取溫度30℃條件下，研究液料比分別為 8∶1、9∶1、10∶1 時對黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.4 提取溫度對黑豆皮花色苷提取效果的影響

在乙酸濃度為30%，液料比為10∶1，提取時間45 min條件下，研究在20、30、40、50℃下對黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.5 提取時間對黑豆皮花色苷提取效果的影響

加入濃度30%的乙酸，液料比10∶1，在30℃，時間10、20、30 min下對黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.2 響應面實驗

利用單因素試驗結果，以超聲波功率、乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度等5個因素，使用Design-ExpertSoft-are6.0軟件設計29個實驗點的響應面分析實驗[8]。試驗設計水平因素見表1。

表1 超聲波萃取法提取黑豆皮中花色苷的響應面試驗設計水平因素Table 1 Ultrasonic wave extraction method withdraws in the black dried bean curd the variety glucoside response to interview examines the design horizontal factor

2 結果與分析

2.1 黑豆皮色素含量的測定

經測定，黑豆皮色素的吸收峰在512 nm處；以黑豆皮色素溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作出黑豆皮色素含量測定標準曲線，其回歸方程為：y＝0.9636x-0.0268，R2=0.9995，線性關系良好。結果見圖1。

圖1 黑豆皮色素標準曲線Fig.1 Standard curve of anthocyanins in black soybean hull

2.2 超聲波萃取法提取黑豆皮中花色苷的提取工藝研究

2.2.1 超聲波法提取黑豆皮中花色苷的影響因素研究

2.2.1.1 超聲波功率對黑豆皮中花色苷提取效果的影響超聲波功率對黑豆皮中花色苷提取效果的影響，

見圖2。

圖2 超聲功率對黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction of anthocyanins in black soybean hull

從圖2可以看出，隨著超聲波功率的提高，吸光度值有所增大，在90 W時達到峰值后，吸光度值開始慢慢變小。如果超聲波功效太小，細胞破碎不完全，花色苷釋放不完全；而功率太大時，會在提取時間內產生并聚集大量的熱量，破壞花色苷的結構，不利于花色苷的提取[9]。所以90 W條件下的提取效果較佳。

2.2.1.2 提取濃度對黑豆皮中花色苷提取效果的影響

提取濃度對黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖3。

圖3 提取濃度對黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.3 Effect of solvent concentration on extraction of anthocyanins in black soybean hull

由圖3可見，濃度的大小直接影響吸光度的大小。乙酸濃度由10%到30%范圍內吸光度值隨著濃度的增大而增大；而后隨著濃度的逐漸上升，吸光度值緩慢下降。醋酸是一種揮發性酸，濃度過高，極性也隨之發生變化，反而不利于花色苷的溶解和提取[10]。因此當提取濃度為30%左右時，可達到較為理想的花色苷提取效果。

2.2.1.3 液料比對黑豆皮中花色苷提取效果的影響

液料比對黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖4。

圖4 液料比對黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.4 Effect of ratio of solvent and material on extraction of anthocyanins in black soybean hull

從圖4中可以看出，吸光度值隨著料液比的增大而增大，乙酸和黑豆皮色素的比例越大色素中有效成分溶解越多，因為溶劑用量達到一定程度時，花色苷已基本全部溶出[11]，再增加溶劑用量也不會有更好的效果，反而會浪費原料并給后續的純化、干燥等工藝增加困難。因此，在本試驗中，液料比為10∶1時的提取效果較為理想。

2.2.1.4 提取溫度對黑豆皮中花色苷提取效果的影響

提取溫度對黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖5。

圖5 提取溫度對黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction of anthocyanins in black soybean hull

從圖5中可以看出，溫度由低升高時吸光度值先增大后減少，當溫度升到30℃吸光度值達到最大值。這主要是由于超聲波的空化作用本身會在局部產生高溫高壓[12]，雖然本試驗總體提取溫度都不是很高，但由于是在超聲波輔助提取的條件下，也會或多或少影響花色苷的穩定性，因此吸光度會有所下降。

2.2.1.5 提取時間對黑豆皮中花色苷提取效果的影響

提取時間對黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖6。

圖6 提取時間對黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.6 Effect of time on extrction anthocyanins in black soybean hull

從圖6可以看出，隨著時間的增加，吸光值逐漸呈上升的趨勢，當提取時間到達30 min以后，吸光值基本保持不變。主要是因為超聲時間較短時，花色苷不易溶出[13]，從節省能源的角度考慮，提取時間在30 min提取效果最佳。

2.2.2 多因素響應面試驗結果

2.2.2.1 超聲波響應面試驗結果與方差分析

超聲波響應面試驗結果與方差分析，見表2。

表2 超聲波萃取黑豆皮中花色苷的響應面數據表Table 2 Ultrasonic extraction of anthocyanins from black hull by response surface methodology

續表2 超聲波萃取黑豆皮中花色苷的響應面數據表Continue table 2 Ultrasonic extraction of anthocyanins from black hull by response surface methodology

由上述結果，經分析，花色苷吸光度的數學模型如下：

吸光度=-2.96434+0.055844×A+（7.40017E-003）×B+0.19761×C+0.019187×D+0.022359×E-（1.67857E-005）×A×B+（1.00000E-004）×A×C-（3.75000E-005）A×D+（9.16667E-006）×A×E+（1.37143E-004）×B×C-（1.14286E-005）×B×D-（3.33333E-006）×B×E+（7.20000E-004）×C×D-（2.13333E-004）×C×E-（4.11111E-005）×D×E－（3.61615E－004）×A2－（8.39966E－005）×B2－0.016543×C2－（3.06944E－004）×D2－（4.60648E－004）×E2

式中：A為超聲波功率，W；B為乙酸濃度，%；C為液料比，（mL/g）；D 為浸提溫度；E 為浸提時間，min。

通過方差分析，模型的P<0.01，響應面回歸模型達到顯著水平[14]。逐項顯著性檢驗結果表明，超聲波的功率、乙酸濃度、液料比、浸提溫度、浸提時間相互作用對黑豆中花色苷提取影響顯著。超聲波乙酸提取黑豆皮中花色苷的最佳工藝參數為超聲波功率90 W，乙酸濃度30%，液料比10∶1，提取溫度30℃，提取時間為30 min，得率預測值為0.659%；在該條件下，黑豆皮中花色苷提取率驗證值為0.575%，與預測值的相對誤差為0.084%。

3 討論

近年來，超聲波輔助提取方法在天然產物研究中已經得到了越來越廣泛的應用[15]?；ㄉ疹惖某煞衷谘?、光照、較高溫度下通常不夠穩定[16]，因此在提取技術上，為保證有效成分不破壞、不分解，對技術有特殊的要求。超聲波萃取時處理溫度較低，可有效控制那些具有熱不穩定性功效成分的分解損失；通過促使細胞破壁，可有效提高功效成分的提取率；超聲波處理另一優勢是作用時間較短，本試驗中超聲波萃取30min即可獲最佳提取率，僅為水煮、醇沉法的三分之一或更少，在實際生產中具有重要的意義；此外，超聲波萃取還具有安全性好、操作簡單易行、維護保養方便、萃取效率高、適用性廣、能耗低等優點，是一項具有廣闊前景的應用技術之一。

超聲波輔助提取中，如能與酶共同作用，可能會更有利于花色苷的充分溶出，而本試驗提取的溫度較為接近酶的適宜作用溫度，可能會有效提高花色苷的提取率，有待進一步研究。該試驗同時也為我國傳統“醋泡黑豆”中活性成分的研究提供了一定的參考。

4 結論

以超聲波輔助提取黑豆皮花色苷色素的工藝中，超聲波功率、乙酸溶液的濃度、提取時間、提取溫度、液料比等因素均對花色苷提取率有一定的影響。在單因素試驗基礎上，通過二次回歸設計得到了黑豆皮中花色苷乙酸超聲波提取率與超聲功率、超聲溫度、超聲時間、液料比關系的回歸模型，經檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好的預測黑豆皮中花色苷的超聲提取率。利用模型的響應面及其等高線，對影響黑豆皮中花色苷超聲提取的關鍵因素及其相互作用進行探討，超聲波乙酸提取黑豆皮中花色苷的最佳工藝參數為超聲波功率90 W，乙酸濃度30%，液料比10∶1，提取溫度30℃，提取時間為30 min，得率預測值為0.659%；在該條件下，黑豆皮中花色苷提取率驗證值為0.575%，與預測值的相對誤差為0.084%。

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