藍莓多酚的萃取及抗氧化活性研究

程安瑋， 房 凱， 王文亮， 劉麗娜， 靳 瓊

(山東省農業科學院農產品研究所，山東濟南 250100)

藍莓多酚的萃取及抗氧化活性研究

程安瑋， 房 凱， 王文亮， 劉麗娜， 靳 瓊

(山東省農業科學院農產品研究所，山東濟南 250100)

研究了不同萃取溶劑及pH值對藍莓中可萃取多酚(EPP)和不可萃取多酚(NEPP)萃取率的影響，并用DPPH法研究了這兩類多酚的抗氧化活性．結果表明，加入甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑可明顯提高EPP的萃取率，其中以50%乙醇的萃取率最高．采用硫酸水解法分離制備NEPP，結果表明，藍莓的NEPP含量遠遠高于EPP．EPP的抗氧化活性與其含量呈正相關性．萃取溶液pH值對EPP萃取率具有明顯的影響，pH值越低，可萃取率越高．

藍莓;可萃取多酚;不可萃取多酚;抗氧化活性

藍莓屬于杜鵑花科越橘屬植物，因其具有較高的保健營養價值，所以風靡世界，被譽為“黃金漿果”．我國對藍莓的研究始于20世紀80年代初，到目前，我國種植總面積達到上千公頃．藍莓近些年來引起人們的廣泛關注，最主要的就是多酚含量很高，并賦予其獨特的活性．研究證明:藍莓具有抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用，這些作用主要是由高含量的多酚所介導的［1］．2007年，Saura-Calixto等［2］指出總多酚(total polyphenols，TPP)是指可萃取多酚(extractable polyphenols，EPP)和不可萃取多酚(non-extractable polyphenols，NEPP)的總和．目前對植物多酚的研究主要集中在EPP，而很少關注NEPP．如果考慮NEPP，水果中有益多酚如原花青素、鞣花酸、兒茶酚含量遠遠超出人們的估計．目前這些NEPP一直不被列為食物的營養組成，實際上這些NEPP是食物中具有生物活性的成分，可被結腸中細菌發酵，產生的代謝產物對人體十分有益．有關NEPP早在1973年就有研究，但由于缺乏合適的分析研究方法，一直沒有引起人們的注意［3］．

多酚的萃取方法主要有微波萃取、超聲萃取、膜分離、超臨界萃取等，但提取率受酚類物質復雜的組成、不同聚合度以及原料結構性質差異等諸多因素影響．藍莓中的多酚比其他果類高，特別是花青素的含量在所有果蔬原料中是最高的，但目前國內對多酚的研究主要集中在可萃取多酚含量差異、抗氧化等方面［4－5］．本研究以新鮮藍莓為實驗原料，采用超聲萃取的方法，比較不同萃取溶劑及溶劑的pH值對藍莓EPP萃取率的影響，然后用硫酸加熱水解出NEPP，測定NEPP的含量，進一步采用DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)法比較EPP和NEPP的抗氧化活性及差異，以期為藍莓多酚的產業化應用提供理論基礎．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

8月份從當地超市購買的新鮮成熟的高叢藍莓(Vaccinium corymbosum L．)，用組織勻漿機打成漿后真空冷凍干燥成粉狀，貯藏備用．

1.2 實驗儀器

RF-5301PC型可見分光光度計，日本島津公司;組織勻漿機，飛利浦公司;FD-1C-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司．

1.3 試劑

2N福林酚試劑和標準品沒食子酸(gallic acid)，Sigma 公司;Na2CO3、H2SO4、HCl、甲醇、乙醇、丙酮及DPPH均為分析純，上海國藥集團化學試劑公司．

1.4 實驗方法

1.4.1 藍莓EPP的制備

稱取約0.3 g干燥的藍莓粉放于具塞試管中，按質量(g)體積(mL)比為1∶30加入不同的萃取溶劑，萃取溶劑的pH值用2 mol/L的鹽酸進行調節，擰緊瓶塞，超聲提取1 h，頻率為400 Hz，溫度為45℃，4 000 r/min離心5 min，分離上層液和沉淀，重復提取兩次，合并上清液，并測定萃取液中EPP的含量．

1.4.2 藍莓NEPP的制備

將提取EPP后的藍莓沉淀在40℃下干燥后稱重，置于帶塞的試管中，加入5 mL體積比為90∶10的甲醇/H2SO4萃取液，擰緊瓶塞，在80℃水浴中加熱 20 h，冷卻后 4 000 r/min 離心 5 min［6］，測定上清液中NEPP的含量．

TPP為EPP和NEPP之和．

1.4.3 多酚含量的測定

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法［7］．取100 μL多酚萃取液，加2 mL蒸餾水，再加200 μL福林酚試劑混勻，3 min后加900 μL Na2CO3(20 g/mL)混勻，在暗處放置2 h后，于分光光度計測定765 nm處吸光度．以沒食子酸為標準品，在10×10－6～500×10－6內制定標準曲線，根據標準曲線計算多酚的含量，結果表示為mg/g DW(DW為干物質重)．每個處理重復3次，取平均值，結果以±s表示．

1.4.4 清除DPPH自由基能力的測定

取0.5 mL多酚提取液與2.5 mL DPPH溶液(250 μmol/L，用甲醇配制)混合，室溫下避光放置60 min，在517 nm處測定吸光度值(A1)，以萃取溶劑替代萃取液作為空白對照，同時測定純DPPH溶液的吸光度值(A0)［8］．

清除自由基的能力=［(A0－A1)/A0］×100%．

1.5 統計分析

采用SAS9.0統計軟件對測定結果進行顯著性檢驗(p＜0.05)．

2 結果與分析

2.1 不同萃取溶劑對藍莓多酚萃取率的影響

首先研究不同萃取溶劑對藍莓中多酚萃取率的影響，如表1．

表1 萃取溶劑對藍莓中EPP和NEPP萃取率的影響Tab．1 Effect of solvent on EPP and NEPP contents mg/g DW

由表1可知，水中加入一定比例的有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮)，可明顯提高EPP的萃取率．添加甲醇實驗組，隨著甲醇體積比的降低，EPP萃取率呈增加的趨勢，乙醇組也表現出相同的趨勢．添加丙酮實驗組中，以丙酮體積分數為75%的EPP萃取率最高，當純丙酮作為萃取溶劑時，EPP萃取率最低，甚至比以純水為溶劑所萃取的EPP還低，僅有3.32±0.21 mg/g DW，只有最大值的1/3(50%乙醇組)．總的來看，萃取溶劑中添加一定比例的乙醇，EPP的萃取率相對較高，特別是乙醇體積為50%時，EPP的萃取率最大，為10.65±1.49 mg/g DW．

藍莓提取EPP后的沉淀，用甲醇/H2SO4加熱水解得到NEPP，并測定其含量．結果表明，藍莓中NEPP的含量遠遠高于EPP的含量，甚至超過7倍，最高的含量達到23.63±1.22 mg/g DW．NEPP的含量變化趨勢與EPP的相反，也就是說，EPP含量相對較高的實驗組中，經過加熱水解，NEPP的含量相對較低．各實驗組中NEPP的含量為18.90±0.15 mg/g DW至23.63±1.22 mg/g DW．

將EPP和NEPP相加，得到TPP的含量．從得到的數據看，各實驗組中TPP的含量為26.95～29.55 mg/g DW，相差不大，平均得到藍莓中總多酚的含量約為28.41 mg/g DW．

2.2 不同萃取溶劑對藍莓多酚抗氧化能力的影響

將分離的EPP與NEPP進行抗氧化能力的測定，結果見表2．可萃取部分對DPPH清除自由基的能力與其濃度呈正相關，EPP的含量越高其對自由基的清除能力越強，NEPP對自由基的清除能力要低于可萃取部分．低pH值的溶液可降低多酚自由基的清除能力，酸度值越低，所表現的自由基清除能力越低．由于NEPP是用硫酸水解所得，各組的酸度很大且差別不大，除了100%的丙酮組，其余各組所表現的DPPH自由基清除能力差別不大．

有關多酚含量與其抗氧化能力之間的相關性研究較多，大量的研究證明多酚的濃度與抗氧化性呈現很好的正相關性［9－10］，但 Sellappan 等［11］的實驗表明，兩者之間的相關性較差．由于受酸度的影響，NEPP所表現的抗氧化活性相比EPP的偏低，且各實驗組之間差別不明顯．

表2 萃取溶劑對藍莓中多酚抗氧化能力的影響Tab．2 Effect of solvent on antioxidant activity of polyphenols%

2.3 pH值對藍莓多酚萃取率的影響

根據2.1中分析結果，選用EPP萃取率最高的組，50%乙醇作為萃取溶液，用2 mol/L的鹽酸調節萃取溶液的pH值，研究萃取溶液的pH值對多酚萃取率的影響，結果見表3．溶液的pH值對EPP的萃取率有一定的影響，降低溶液的pH值有利于EPP的萃?。瑯覰EPP的含量明顯高于EPP，NEPP的變化趨勢與EPP的變化趨勢相反，EPP萃取率較高的組，NEPP的萃取率就相對較低．計算TPP的含量，3個實驗組中TPP含量沒有差別，與2.1的結果是一致的．

表3 溶液pH值對藍莓中EPP和NEPP的影響Tab．3 Effect of pH on EPP and NEPP contents mg/g DW

2.4 pH值對藍莓多酚抗氧化能力的影響

進一步研究萃取溶劑pH值對藍莓中多酚清除DPPH自由基能力的影響，結果見表4．由表4可知，pH值可明顯影響多酚對自由基的清除能力，EPP的濃度與抗氧化能力間不呈正相關性，溶液的pH值越高，所表現的清除自由基能力越強．NEPP所表現的清除自由基能力低于可萃取部分，這主要是在制備NEPP時，水解液中加入10%的硫酸，強酸可能影響DPPH反應體系．許申鴻等［12］研究證明，pH值對DPPH抗氧化體系的影響較大，強酸、強堿使DPPH溶液迅速失效，在pH值為2～10時物質的抗氧化活性隨pH值的升高而降低［12］．

表4 溶液pH值對藍莓多酚抗氧化能力的影響Tab．4 Effect of pH on antioxidant activity of polyphenols%

3 結論

通過研究不同萃取溶劑及pH值對藍莓中多酚萃取率及抗氧化活性的影響，得出結論．

1)萃取溶液中加入甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑可明顯提高EPP的萃取率，添加乙醇的效果要好于甲醇和丙酮，以50%乙醇的萃取率最好．

2)采用甲醇/H2SO4加熱水解的方法，首次研究了藍莓中的NEPP，且NEPP的含量遠遠高于EPP的含量．

3)EPP含量較高的組，其NEPP的含量則相對較低，但總多酚的含量差別不大．

4)EPP的抗氧化活性與其濃度呈正相關，這表明藍莓的抗氧化作用主要是由高濃度多酚所介導的，多酚是表現高抗氧化性的主要物質基礎．

5)溶液的pH值對EPP的萃取率也有明顯的影響，提高溶液的酸度，可提高EPP的萃取率，溶液的pH值也影響多酚的抗氧化能力，酸度越低，表現的抗氧化能力越高，NEPP所表現的抗氧化性與多酚的濃度不呈正相關，這主要受溶液酸度的影響．

［1］Seeram N P．Berry fruits for cancer prevention:current status and future prospects［J］．J Agric Food Chem，2008，56:630-635．

［2］Saura-Calixto F，Sereano J，Goňi I．Intake and bioaccessibility of total ployphenols in a whole diet［J］．Food Chem，2007，101:492-501．

［3］Bate-Smith E C．Tannins of herbaceous legumiae［J］．Phytochemistry，1973，12:1809-1812．

［4］解利利，張慜，孫金才．藍莓凍果多酚粗提物體外抗氧化活性的研究［J］．食品與生物技術學報，2011，30(6):818-821．

［5］劉文旭，黃午陽，曾曉雄，等．草莓、黑莓、藍莓中多酚類物質及其抗氧化活性研究［J］．食品科學，2011，32(23):130-133．

［6］Arranz S，Saura-Calixto F，Shaha S，et al．High contents of nonextractable polyphenols in fruits suggest that polyphenol contents of plant foods have been underestimated［J］．J Agric Food Chem，2009，57:7298-7303．

［7］Slimkard K，Singleton V L．Total phenol analysis and comparison with manual method［J］．Am J Enol Viticult，1977，28:49-55．

［8］Sun T，Tang J，Powers J R．Effect of pectolytic enzyme preparations on the phenolic composition and antioxidant activity of asparagus juice［J］．J Agric Food Chem，2005，53(1):42-48．

［9］Santas J，Carbó R，Gordon M H，et al．Comparison of the antioxidant activity of two Spanish onion varieties［J］．Food Chem，2008，107:1210-1216．

［10］Djeridane A，Yousfi M，Nadjemi B，et al．Antioxidant activity of some algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds［J］．Food Chem，2006，97(4):654-660．

［11］Sellappan S，Akoh C C．Flavonoids and antioxidant capacity of Georgia-grown Vidalia onions［J］．J Agric Food Chem，2002，50(19):5338-5342．

［12］許申鴻，杭瑚．溶劑及pH值對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基分析法的影響［J］．分析測試學報，2000，19(3):50-52．

(責任編輯:葉紅波)

Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols in Blueberries

CHENG An-wei， FANG Kai， WANG Wen-liang， LIU Li-na， JIN Qiong
(Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China)

The effect of solvent and pH on the contents of extractable polyphenols(EPP)and non-extractable polyphenols(NEPP)of blueberries was investigated in this paper．The antioxidant activity of polyphenols was also determined by DPPH system．The results showed that the solvent containing methanol，ethanol and acetone can enhance the EPP contents，especially 50%ethanol．The NEPP contents isolated by the hydrolysis of sulfuric acid were much higher than that of EPP．There is a good correlation between the antioxidant activity and the EPP content．The yield of EPP increased with the decreasing of pH．

blueberry;extractable polyphenols;non-extractable polyphenols;antioxidant activity

TS225.2

A

1671-1513(2012)04-0037-04

2012-03-16

國家自然科學基金青年基金資助項目(31101270)．

程安瑋，女，副研究員，博士，主要從事食品新資源開發方面的研究工作;

王文亮，男，副研究員，主要從事果蔬加工方面的研究工作．通訊作者．