愈美干混懸劑在健康志愿者體內的生物等效性研究*

隋 淼，襲榮剛，王昕南

(中國人民解放軍第210 醫院，大連 116021)

愈美干混懸劑由非成癮性鎮咳藥物氧去甲右美沙芬與祛痰藥愈創木酚甘油醚組成。氧去甲右美沙芬系非依賴性中樞鎮咳藥，直接抑制延腦咳嗽中樞而發揮鎮咳作用，鎮咳作用與依賴性中樞鎮咳藥可待因相似或較強，且不具鎮痛或催眠作用，治療量對呼吸中樞無抑制作用，亦無依賴性和耐受性，起效快，此外尚有阿托品樣抗膽堿作用及解除肌肉痙攣作用。愈創木酚甘油醚通過刺激胃黏膜，反射引起支氣管分泌增加，有利于痰液稀釋及咳出，從而祛痰止咳。兩藥相組合達到了較強的止咳祛痰作用。

根據國家食品藥品監督管理局新藥臨床試驗批文，本研究對大連弘豐藥業發展有限公司生產的愈美干混懸劑(受試制劑)與大連美羅大藥廠生產的愈美片(參比制劑)進行人體相對生物利用度研究，評價兩種制劑的生物等效性。

1 藥品與儀器

1.1 制劑 受試制劑:愈美干混懸劑(規格:每袋2 g，含氫溴酸右美沙芬15 mg 和愈創木酚甘油醚0.1 g，批號050801，大連弘豐藥業發展有限公司提供)。參比制劑:愈美片(商品名可坦，規格:每片含氫溴酸右美沙芬15 mg 與愈創木酚甘油醚0.1 g，批號20051201，大連美羅大藥廠提供)。對照品:氧去甲右美沙芬對照品(含量100%，批號085k4631，由Sigma 公司提供);愈創木酚甘油醚對照品(含量100%，批號100751 -200401，由中國藥品生物制品檢定所提供);左氧氟沙星對照品(含量97.2%，批號100451 -200501，由中國藥品生物制品檢定所提供)。乙腈、甲醇為色譜純;三氯甲烷、異丙醇、磷酸二氫銨、枸櫞酸鈉、檸檬酸均為分析純;β - 葡萄糖苷酸酶(Sigma 公司提供，批號041k70321);水為純凈水;空白血漿(由吉林大學第一醫院提供)。

1.2 儀器 LC -10ATvp 高效液相色譜儀(日本島津公司);AgiLent 1200 1321A 熒光檢測器(美國安捷倫公司);N2000 色譜數據工作臺軟件(浙江大學智達信息工程有限公司);TGL -16G 離心機(上海安亭科學儀器廠);XW-80A 微型旋渦混合儀(上海滬西儀器廠有限公司);FA1004 電子天平(上海恒平科學儀器有限公司);分析天平(上海精科天平公司);MTN -2800W氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。

2 對象和方法

2.1 受試對象20 例男性健康志愿者，年齡(22.25 ±1. 41)歲，體重(66. 35 ± 8. 72)kg，身高(173.55 ±9.57)cm。受試者均無心、肝、腎、代謝異常等病史，無慢性胃腸道疾病，無吸煙、嗜酒等不良嗜好。經全面體檢，血、尿常規，肝、腎功能，X 線透視，血壓及心電圖均無異常發現。所有受試者均被告知試驗過程及相關不良反應并簽署知情同意書。

2.2 分組與給藥 本研究為單劑量給藥試驗，用兩制劑雙周期自身對照交叉試驗設計。受試者隨機分為兩組，試驗前禁食10 h，試驗日晨空腹用200 ml 溫開水送服試驗制劑4 袋或參比制劑4 片，服藥后2 h 內禁水，給藥4 h 后給予統一低脂肪、低蛋白標準餐。20 名受試者服藥1 周后交叉給藥，重復上述試驗。服藥期間禁煙、酒和含咖啡因類飲料，避免劇烈運動和長時間臥床。試驗前2 周至試驗期間不服用任何其他藥物。

2.3 血樣采集 受試者于服藥前(0 h)和服藥后的0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12 和24 h 于上肢靜脈取血5.0 ml 置于肝素管中;離心(3 500 r/min)10 min分離血漿;置-70 ℃冰箱保存待測。

3 血藥濃度測定與方法學評價

3.1 色譜條件 色譜柱:DimanosiL C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);預柱:C18保護柱;流動相:甲醇- 乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫銨(5∶ 17∶ 78，用36%醋酸調解pH 值3. 65 ～3. 70);流速:1. 0 ml/min;柱溫:25 ℃;激發波長:280 nm;發射波長:313 nm;進樣量:20 μl。

3.2 樣品處理

3.2.1 酶解 精密量取血漿250 μl，加入β -葡萄糖苷酸酶溶液(3 000 U/ml)100 μl、0.1 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖溶液100 μl，渦旋30 s，置37 ℃恒溫水浴中水解16 h，取出，放冷。

3.2.2 血漿提取 在上述酶解后的血漿樣品中，精密加入乙腈50 μl、甲醇50 μl、內標溶液(1.66 mg/ml 左氧氟沙星溶液)50 μl、飽和的碳酸鈉溶液200 μl，渦旋30 s;加入三氯甲烷-異丙醇(4∶ 1)3 ml，振蕩10 min，10 000 r/min 離心5 min;吸取有機相，在40 ℃水浴中氮氣吹干，用100 μl 流動相復溶，移至1.5 ml 離心管中，15 000 r/min 離心5 min，取上清液20 μl 進行分析。

3.3 標準曲線制備 精密量取250 μl 空白血漿，分別加入不同濃度的氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚標準溶液各50 μl，分別配制成氧去甲右美沙芬藥物濃度為10. 04、20. 08、50. 20、100. 40、200. 80、502. 00、1 004.00、2 008.00、2 510.00 ng/ml 和愈創木酚甘油醚藥物濃度為20.06、50.16、100.32、200.64、401.28、1 003.20、1 504.80、2 006.40、2 508.00 ng/ml 的血漿樣品，按“3.2”項下方法操作，進行雙樣本分析，制備氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚的標準曲線。以待測物濃度(X，ng/ ml)為橫坐標，待測物峰面積比(Y，As/Ai)為縱坐標，用加權最小二乘法(權重系數:1/ X2)進行線性回歸運算［1］，求得直線回歸方程。氧去甲右美沙芬回歸方程為Y = 0.003 85 + 0. 002 69 X (r =0.999 51);愈創木酚甘油醚回歸方程為 Y =0.018 22 +0.003 72 X(r =0.999 22)。結果表明，氧去甲右美沙芬在10.04 ～2 510.00 ng/ml 范圍內線性關系良好，最低檢測濃度為10.04 ng/ml(S/N ＞10);愈創木酚甘油醚在20.06 ～2 508.00 ng/ml 范圍內線性關系良好，最低檢測濃度為20. 06 ng/ml(S/N ＞10)。

3.4 提取回收率 取空白血漿250 μl，分別精密加入不同濃度的氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚標準溶液各50 μl，分別配制成氧去甲右美沙芬藥物濃度為20.08、200.80、2 008.00 ng/ml 和愈創木酚甘油醚藥物濃度為50.16、401.28、2 006.40 ng/ml 的血漿樣品各3份，按“3.2”項下方法操作，獲得相應色譜峰面積A;同時另取空白血漿250 μl，除不加標準系列溶液和內標外，按“3.2”項下方法操作，向獲得的有機相中加入相應濃度的標準溶液50 μl 和內標溶液50 μl，渦流混合，氮氣吹干后用100 μl 流動相復溶，取樣20 μl 進行分析，獲得相應色譜峰面積A’(三次測定的平均值)。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。提取回收率為A/A’×100%，結果見表1 和表2。結果表明，氧去甲右美沙芬的低、中、高三個濃度的提取回收率為69.05% ～89.71%，愈創木酚甘油醚的低、中、高三個濃度的提取回收率為72.39% ～87.64%。

3.5 精密度試驗 取空白血漿250 μl，再分別加入不同濃度的氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚標準溶液各50 μl，分別配制成氧去甲右美沙芬藥物濃度為20.08、200.80、2 008.00 ng/ml 和愈創木酚甘油醚藥物濃度為50.16、401.28、2 006.40 ng/ml 的血漿樣品，按“3.2”項下方法試驗，在不同天的時間內連續制備并測定3 個分析批，每批樣品分為低、中、高三個濃度水平，每個濃度進行六樣本分析，計算日內和日間精密度，數據見表1 和表2。

表1 氧去甲右美沙芬精密度與回收率試驗結果

表2 愈創木酚甘油醚精密度與回收率試驗結果

3.6 穩定性試驗 取250 μl 空白血漿，分別加入不同濃度氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚標準溶液各50 μl，分別配制成氧去甲右美沙芬藥物濃度為20. 08、200.80、2 008.00 ng/ml 和愈創木酚甘油醚藥物濃度為50.16、401.28、2 006.40 ng/ml 的血漿樣品，每個濃度各9 份，3 份按“3.2”項下方法試驗，在室溫放置24 h后進樣分析，考查血漿樣品在室溫條件下的穩定性;3份于-70 ℃冰箱冷凍，反復凍融三次后，按“3.2”項下操作，進樣分析，考查血漿樣品的反復凍融穩定性;另3份于-70 ℃冷凍保存13 d 后，按“3.2”項下方法操作，進樣分析，考查血漿樣品在長期冷凍條件下的穩定性。結果顯示RSD 均小于15%，表明氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚在室溫24 h、反復凍融以及長期冷凍條件下穩定性均較好。

3.7 專屬性 空白人血漿、對照品血漿樣品和受試者血漿樣品的色譜圖見圖1。氧去甲右美沙芬、愈創木酚甘油醚和內標左氧氟沙星分離完全，峰形良好，其保留時間分別為9、12 和6 min。結果表明，血漿中內源性物質不干擾氧去甲右美沙芬、愈創木酚甘油醚和內標的測定。

圖1 空白血漿(A)對照品+空白血漿(B)血漿樣品(C)HPLC 色譜圖

3.8 數據處理 用Das 2.0 程序處理20 名受試者的血藥濃度-時間數據并進行計算。采用梯形法計算AUC0-t值和AUC0-∞值，以半對數作圖法，由消除相的濃度點計算T1/2，Tmax和Cmax采用實測值，相對生物利用度(F)按公式:F =AUC0-t(受試制劑)/AUC0-t(參比制劑)×100%計算。AUC 和Cmax經對數轉換后采用方差分析進行處理，并進一步采用(1 -2 α)置信區間和雙單側t 檢驗法評價制劑的生物等效性;Tmax采用非參數法檢驗(Wilcoxon 秩和檢驗)，對兩種制劑作出生物等效性評價。

4 結果

4.1 血藥濃度-時間曲線及藥代動力學參數 血漿中氧去甲右美沙芬濃度，愈創木酚甘油醚濃度數據經Das 2.0 程序處理得到各主要藥代動力學參數，試驗藥與對照藥的平均藥時曲線如圖2 和圖3;主要藥代動力學參數見表3 和表4。

圖2 氧去甲右美沙芬平均血藥濃度-時間曲線

圖3 愈創木酚甘油醚平均血藥濃度-時間曲線

表3 氧去甲右美沙芬藥代動力學參數(n=20，±s)

表3 氧去甲右美沙芬藥代動力學參數(n=20，±s)

參數參比制劑試驗制劑Tmax(h)2.08 ±0.441.65 ±0.33 Cmax(ng/ml)1 069.79 ±237.261 136.79 ±242.38 AUC0-t ng·h/ml5 601.46 ±873.045 893.07 ±938.43 AUC0-∞(ng·h/ml)5 723.04 ±848.066 029.60 ±893.16 T1/2(h)3.48 ±1.184.13 ±0.87

表4 愈創木酚甘油醚藥代動力學參數(n=20，±s)

表4 愈創木酚甘油醚藥代動力學參數(n=20，±s)

參數參比制劑試驗制劑Tmax(h)0.71 ±0.120.61 ±0.13 Cmax(ng/ml)1 432.73 ±296.471 495.27 ±319.32 AUC0-t(ng·h/ml)2 056.16 ±424.272 091.43 ±413.87 AUC0-∞(ng·h/ml)2 102.87 ±424.352 144.17 ±417.22 T1/2(h)0.86 ±0.230.88 ±0.10

4.2 生物等效性 以愈美片為參比制劑，用面積法估算愈美干混懸劑的相對生物利用度、氧去甲右美沙芬為(105. 6 ± 9. 9)%、愈創木酚甘油醚為(102. 1 ±6.8)%，符合生物利用度要求。

將受試制劑愈美干混懸劑和參比制劑愈美片對氧去甲右美沙芬的血藥濃度- 時間曲線下面積ln(AUC0-t)、ln(AUC0-∞)經方差分析無顯著性差異;(1 - 2α)置信區間分別為101. 7% ～108. 7% 和102.1% ～108.7%，經雙向單側t 檢驗，受試制劑AUC的90%可信限在參比制劑的80% ～125%范圍內，表明兩種制劑在吸收程度上具有生物等效性;Tmax經非參數檢驗，兩制劑間無顯著性差異(P ＞0.05)。

兩制劑的愈創木酚甘油醚AUC0-t、AUC0-∞經對數轉換后進行方差分析無顯著性差異;(1 -2α)置信區間分別為99.6% ～104.3%和99.5% ～104.7%，經雙向單側t 檢驗，受試制劑AUC 的90%可信限在參比制劑的80% ～125%范圍內，表明兩種制劑在吸收程度上具有生物等效性;Tmax經非參數檢驗，兩制劑間無顯著性差異(P ＞0.05)。

5 討論

氫溴酸右美沙芬在體內代謝后，其活性代謝物(氧去甲右美沙芬)的含量可為原形物的20 ～100倍［2］，所以選擇氧去甲右美沙芬作為本試驗的待測物之一。

熒光檢測器比紫外檢測器具有檢測靈敏度高、結果準確等特點，因此采用高效液相色譜-熒光檢測器檢測血漿中氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚濃度，方法較為理想。參照文獻［3-5］中血藥濃度測定的檢測波長，選用280 nm 作為激發波長、313 nm 作為發射波長。

本文采用的提取溶劑選擇性高，毒性低、沸點低、易于操作;參照文獻［4，5］內標的選擇，選用鹽酸曲馬多為內標進行色譜條件考查，靈敏度低，試驗結果不理想;經試驗后，最終確定選用提取特性與氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚相似的左氧氟沙星作為內標，消除了系統誤差，同時靈敏度大大提高。

本試驗受試驗制劑為干混懸劑，參比制劑為普通片劑，氧去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚的代謝和吸收也受到劑型的影響，因二者劑型不同，干混懸劑較片劑吸收速度快，受試與參比制劑的氧去甲右美沙芬Tmax為(1.65 ±0.33)h 和(2.08 ±0.44)h ，愈創木酚甘油醚的Tmax為(0.61 ±0.13)h 和(0.71 ± 0.12)h，從統計結果來看其差異較為顯著。

1 鐘大放. 以加權最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題. 藥物分析雜志，2006，16(5):343

2 杜玥，鐘大放，肇麗梅，等.愈美分散片人體藥動學及制劑生物等效性研究. 沈陽藥科大學學報，2007，18(3):157

3 陶欣，卓海通，何秀萍，等. 氫溴酸右美沙芬咀嚼片的藥代動力學和相對生物利用度.中國藥理學通報，2005，15(3):271

4 葛慶華，周臻，王浩，等. 人血漿中右美沙芬及去甲右美沙芬的HPLC-熒光法測定.中國醫藥工業雜志，2009，34(9):456

5 葛慶華，周臻，支曉瑾，等. 血漿中去甲右美沙芬和愈創木酚甘油醚的HPLC 測定.中國醫藥工業雜志，2010，35(1):32