纖維素分解菌的篩選及其不同組合對秸稈降解的效果

■張立霞 李艷玲 屠 焰 張乃鋒 劉 策 刁其玉

（中國農業科學院飼料研究所，農業部飼料生物技術重點開放實驗室，北京100081）

植物纖維素是一種很重要的可再生資源，但是大量的纖維素并沒有被合理利用，而是被焚燒或者被隨意丟棄。因此，國內外做了很多關于降解纖維素的微生物的研究，目前主要集中在康寧木霉、里氏木霉、黑曲霉等方面，用于固態發酵和堆肥。纖維素是植物材料的主要成分，在一定條件下可以被水解成單糖，單糖可以被動物直接利用，或者是通過微生物發酵生產各種有用的產品，如飼料、食品、藥品。植物纖維素中產量最大的是農作物秸稈，秸稈除了焚燒，大部分用于堆肥返田，利用效率及經濟效益都不高。如果能找到高效降解農作物秸稈的微生物或者微生物組合，進行發酵降解其中的纖維素和木質素，提高秸稈的營養價值，并進行進一步的加工，將農作物秸稈大量轉化為營養價值較高的動物飼料，將大大提高農作物秸稈的利用率。

秸稈利用率不高的主要原因是較高的木質素、纖維素含量，其不僅阻礙了動物體對秸稈的利用，同時也是生產生物酒精、糖等的障礙[1]。但是，經過微生物處理后纖維素的降解率仍然不高，主要是因為木質素形成的骨架結構阻礙了微生物對纖維素的降解。因此，本試驗旨在尋找能高效降解木質素和纖維素的微生物組合，用于提高秸稈的營養價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黃孢原毛平革菌(Phaerochaete chrysosporium 5.776），購于中科院微生物菌種保藏中心,編號PC；黑曲霉（Aspergillus niger）SY1-2分離自四川鹽湖的土壤中；青霉菌（Penicillium sp.）SP-1、瓶霉（Phialophora spp.）G5分離于云南錫礦的酸性廢水中；毛殼霉（Chaetomium）SZ-8分離于沙土中；綠色木霉（Trichoderma viride）Y-1分離于瑞萊德微生物催熟劑中；以上來源于中國農業科學院飼料研究所生物化學與分子實驗室，所有菌種保藏于PDA培養基中，置于4℃冰箱中。

1.1.2 材料

玉米秸稈，來源于北京通州，自然晾干，粉碎過40目篩，放于自封袋保存。

1.1.3 培養基

PDA：39 g粉末（DifcoTMPotato Dextrose Agar,BD公司）溶于1 L水中，121℃滅菌15 min。試驗菌株孢子長滿斜面后用無菌水制成孢子懸液，利用血球計數板計數，達到108個/ml。

PDB：24 g粉末（DifcoTMPotato Dextrose Agar,BD公司）溶于1 L水中,121℃滅菌15 min。

剛果紅篩選纖維素瓊脂培養基：CMC-Na 1.88 g、明膠 2 g、剛果紅 0.2 g、KH2PO40.5 g、Mg?SO4·7H2O 0.25 g、瓊脂 15 g，自然pH值，用蒸餾水定容至1 L。121 MPa、20 min滅菌備用。使用前加100 μl氨芐青霉素。

固體發酵培養基：稱取20 g秸稈,加入5 g的麩皮,按質量與體積比1∶1(w/v)的Mendel營養液[2],充分攪拌，120℃濕熱滅菌20 min后，置于恒溫培養箱中30℃，發酵10 d，每天取樣測定酶活。10 d后，取出樣品，烘干測定NDF(中性洗滌纖維)、ADF(酸性洗滌纖維)、ADL(酸性洗滌木質素)。

1.2 菌種篩選

1.2.1 纖維素分解菌的篩選[3]

采用菌餅接種法[4]將長滿均勻孢子，d=4 mm的菌餅接種到剛果紅纖維素培養基中，30℃培養箱中培養，出現透明水解圈的菌株為纖維素降解菌，測定菌落直徑（d，cm）和水解圈直徑（D，cm），采用D0=D/d表示水解能力。纖維素剛果紅平板透明圈直徑與菌落直徑(d)的比值(D/d)可以用于初步判斷纖維素降解菌酶活力的大小，其大小直接反映了纖維素酶濃度的相對高低[5]。

1.2.2 纖維素分解菌酶活的測定

將初篩得到的菌株在PDA上培養，用接種環將新鮮菌絲接種于PDB中，30℃、200 r/min振蕩培養7 d，每天取樣測定纖維素酶酶活。

1.2.3 纖維素分解菌與黃孢原毛平革菌組合降解秸稈的效果

將組合菌株按孢子數以等比例接種在秸稈固體發酵培養基中，30℃培養，每天取樣測定纖維素酶活、木質素降解酶活，發酵10 d后，將發酵樣品取出，65 ℃烘干2 d，測定秸稈NDF、ADF、ADL及纖維素、半纖維素的含量。

1.3 酶活測定

粗酶液的制備：發酵樣取出后按1∶10的比例加入去離子水，于150 r/min搖床上振蕩1 h，濾紙過濾，濾液作為粗酶液。

①濾紙酶活測定(Ghose,1987)

在pH值5.0、50℃條件下，在50 mmol/l的磷酸氫二納-檸檬酸緩沖液中測定。

校正：1.5 ml 50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,加入3.0 ml DNS,煮5 min,540 nm測定OD值,用于校正分光光度計的0值。

酶液對照：1.0 ml 50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,加入0.5 ml酶液和3.0 ml DNS,煮5 min,540 nm測定OD值,和0值相比得到酶液對照。

標準液的制備：葡萄糖在100℃烘2 h至恒重,配成10 mg/ml儲存液，并作表1的稀釋梯度。

表1 不同濃度的葡萄糖標準溶液

標準曲線的制作：0.5 ml不同濃度葡萄糖標樣，加入1.0 ml 50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和3.0 ml DNS，煮5 min后加入20 ml蒸餾水，540 nm測定OD值，測定得到的值要減去酶液對照的值。

酶活定義為：每分鐘轉化底物生成1 μmol產物所需要的酶量。最終得到在反應體系中釋放2 mg葡萄糖的酶活力為0.37 U/ml。

酶活測定條件：在上述同樣條件下,加入1 cm×6 cm濾紙作為底物,加入1.0 ml pH值5.0、50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和0.5 ml酶液,50℃反應60 min,測定酶活。

②羧甲基纖維素酶活（CMCase）的測定

2%低黏度CMC-Na，同上方法制備濃度為2 mg/ml的儲存液，進行梯度稀釋見表2。

表2 不同濃度的CMC-Na溶液

校正空白：0.5 ml底物,在50 ℃放置30 min,加入3 ml DNS和0.5 ml緩沖液,煮5 min,加入20 ml蒸餾水,在540 nm測OD值,用于分光光度計調0。

酶液對照：0.5 ml底物,在50 ℃放置30 min,加入3 ml DNS 和0.5 ml酶液,煮5 min,加入20 ml蒸餾水,在540 nm下測OD值,和校正空白相比得出酶液對照。

標準曲線：0.5 ml底物,在50 ℃放置30 min,加入3 ml DNS和0.5 ml不同濃度標樣,煮5 min,加入20 ml蒸餾水,在540 nm下測OD值,減去酶液對照。

酶活定義為：每分鐘轉化底物生成1 μmol產物所需要的酶量。

將0.5 ml的酶液預熱至50℃,后加入0.5 ml底物進行反應,按標準反應測定酶活。

③以pNPG為底物測定糖苷酶酶活

250 μl底物,加入250 μl適當稀釋的酶液,在一定溫度下反應10 min，加入1.5 ml 1 M Na2CO3溶液，在405 nm處測定OD值(Baldrian等，2006)。

酶活單位定義為：在最適溫度和條件卜,每分鐘釋放1 μmol pNPG所需耍的酶量(U/ml)。

④木聚糖酶酶活測定

木聚糖酶酶活測定采用DNS法(Miller，1959)，反應體系包括100 μl酶液和900 μl樺木木聚糖,在50 mM、pH值5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中,50℃反應10 min,加入1.5 ml DNS,煮5 min終止反應,在540 nm處測定OD值。

⑤Lac漆酶酶活的測定

參見吳坤（2002）的方法[6]。

⑥Mnp酶活的測定

參見王佳玲（1998）的方法。

⑦木質素過氧化物酶(Lip)活力的測定

參見燕紅等（2011）的方法[7]。

2 結果

2.1 纖維素降解菌的篩選（見圖1、表3）

圖1 纖維素降解菌產生的透明圈

剛果紅培養基作為篩選培養基，可以很快識別出纖維降解能力的高低，方便了篩選。從圖1和表3中可看到，試驗所用菌株A4、A5在32 h沒有產生透明圈，A7在32 h時產生的透明圈較小。測量不同菌株的D/d的比值發現，A1、A2的D/d的比值分別為1.65和1.68，且在試驗的8 h時已經產生了明顯的透明圈，同時A2的菌絲在培養基上的生長速度較快。A6和A8都屬于木霉屬，D/d的比值一樣，但是A8的生長速度比A6快。所以在本試驗中選擇A2、A3、A8和PC作為初步篩選的纖維素降解菌株。

表3 各菌株的D/d比值和生長情況

纖維素降解菌可以產生纖維素酶，而纖維素酶是一種多組分的酶系，是能夠降解β-1,4-糖苷鍵的水解酶的組合，天然纖維素正是在這種復合水解酶的協同作用下被降解?，F今，纖維素酶水解的機制仍無統一的共識，但目前較為普遍的是協同理論，即纖維素降解酶普遍認為是所有參與降解纖維素的各種酶的總稱，主要包括外切葡聚糖酶(CBH)、內切葡聚糖酶(EG)和β-葡聚糖酶(BG)。外切酶將纖維素分子分解為短鏈分子，再由內切酶進行切割，形成纖維二糖，最終由β-葡聚糖酶降解成葡萄糖。在秸稈中半纖維素降解酶主要是木聚糖酶，與纖維素酶具有很好的協同性[8]。故測定相應菌株的4種酶活即可以反映降解纖維素能力的大小。為進一步驗證上述試驗中所得出的A2、A3、A8和PC作為初篩纖維素降解菌，在本試驗中，分別測定了FPA、CMCase、β-葡糖苷酶用來作為鑒定菌種纖維素分解能力的大小，同時測定了木聚糖酶的活性作為比較半纖維素分解能力的指標(見圖2～圖5)。

圖2 不同真菌在PDB中的FPA活性

對剛果紅試驗篩選到的菌株進行產酶能力的比較，發現FPA、β-葡糖苷酶的產酶高峰均在第4 d出現，而CMCase、木聚糖酶的產酶高峰在第2 d。FPA代表總纖維素酶活力，從圖2可以看出，PC和木霉A8 FPA酶活性明顯高于其他真菌，分別為0.114、0.112 U/ml，A6的CMCase的活力最高，A2的木聚糖酶活力最高，A3的β-葡糖苷酶活性最高，為0.801 U/ml。A2的β-葡糖苷酶的活性比A1的低，A2其他3種酶都比A1的高（但是在第5 d，CMCase A1＞A2，可能與測定酶活過程中試驗操作及底物濃度的控制有關）。A8的β-葡糖苷酶活性比A6低，但是A8的FPA活力高于A6，與前面剛果紅試驗中得出的結論相符。

圖3 不同真菌在PDB中的CMCase的活性

圖4 不同真菌在PDB中β-葡糖苷酶的活性

圖5 不同真菌在PDB中的木聚糖酶活性

2.2 纖維素分解菌與黃孢原毛平革菌組合降解玉米秸稈（見表4）

在將菌株進行組合前，進行了菌株間拮抗試驗，并沒有出現拮抗現象。將篩選得到的試驗菌株與黃孢原毛平革菌進行組合，固態發酵秸稈10 d，測定酶活，結果見表4。

從表4可以看出，PC+黑曲霉的FPA最高，為0.18 U/ml，PC+木霉的木聚糖酶最高，為0.47 U/ml；PC+黑曲霉+青霉+木霉的Mnp最高，達到了449.58 U/ml；PC+黑曲霉的Lip最高，為25.94 U/ml。不同菌株進行組合，測定了纖維素降解和木質素降解的酶活，表現出協同降解纖維素和木質素的效果。

表4 不同真菌組合固態降解玉米秸稈的酶活（U/ml）

2.3 黃孢原毛平革菌與纖維素降解菌復合降解秸稈的效果研究（見表5）

表5是不同菌株和復合菌株進行玉米秸稈固態發酵10 d后，NDF、ADF、ADL、纖維素、半纖維素的含量。從表5中可以得出，經過不同微生物處理的秸稈5種指標的含量比未經處理的秸稈含量低。NDF含量較低的為黑曲霉、PC+木霉和PC+黑曲霉+青霉+木霉；黑曲霉、PC、PC+木霉、PC+黑曲霉+青霉和PC+黑曲霉+青霉+木霉的ADF含量比較低；ADL含量比較低的為黑曲霉、木霉、PC+黑曲霉和PC+黑曲霉+青霉+木霉；半纖維素含量最低的為PC+黑曲霉+青霉+木霉。

表5 不同真菌組合固態發酵玉米秸稈10 d后木質纖維素的含量（DM,%）

不同菌株產生的纖維素酶的組分不同，與其他菌株進行組合后，不同酶組分相互協同，共同降解纖維素、半纖維素和木質素，增加秸稈的營養價值。根據本試驗結果，篩選能夠較好降解纖維素和木質素的組合為PC+黑曲霉+青霉+木霉。

3 討論

植物木質纖維素是地球上最豐富且廉價的可再生資源，占地球上光合作物的60%以上，并且全球每年通過光合作用產生的植物約10 000億噸，因此，豐富的木質纖維素是有待于利用的非常重要的資源。而植物秸稈木質纖維素的降解一直是國內外普遍關注的問題，且在利用物理方法和化學方法來處理秸稈方面取得了很多成就，但是理化處理一般可以去掉50%的木質素并使纖維素成為非結晶態，但應用于工業化生產存在成本高、易造成再次污染的缺陷[9]。近年來，我國在微生物降解秸稈方面的研究非?；钴S，側重于纖維素分解菌的篩選[10]、纖維素酶活性的研究，也有一些關于真菌纖維素降解機理的報道[11]。利用微生物或者其產生的酶來降解秸稈不僅降解率高，而且安全環保，可再生。

3.1 纖維素分解菌的篩選

所有菌株酶活成分比較復雜，所以之前有進行統一標準的篩選。在篩選好氧單菌時常用的方法是剛果紅染色法。Teather等[12]認為剛果紅染料與水解后的多糖可形成濃郁色澤的復合物，可方便檢測透明圈。Hendrick等[13]將其發展為鑒別培養基。葉姜喻等[3]將其發展成一個方便快捷的培養基，即纖維素剛果紅培養基。以剛果紅為指示劑，透明圈明顯，效果顯著，減少了工作量，提高了工作效率。其原理是剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物，當纖維素被微生物分泌的纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復合物便無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。透明圈出現的越早，越清晰，說明酶類產生的越早，纖維素酶降解越徹底，酶類也越齊全[14]。因此，剛果紅纖維素培養基常被用來快速識別微生物降解纖維素的能力。本試驗采用的菌餅接種法，在8 h時就已經出現了明顯的透明圈，培養32 h后進行菌落直徑和透明圈直徑的測量，得到產纖維素酶活力較高的4株菌A2、A3、A8和PC。PC除具有典型的降解木質素的能力外，還具有降解纖維素的能力。將篩選得到的6株真菌在PDB中培養，測定纖維素酶的活性。CMC酶活反映的是纖維素酶組分中內切酶的活性，FPA酶活反映的是纖維素酶全組分的活力[15]。本試驗中，以β-葡糖苷酶活性進行比較，青霉A3＞黑曲霉A1＞其他菌株；以CMCase活性進行比較，木霉A6＞PC＞其他菌株；以FPA活性進行比較，PC＞木霉A8＞其他菌株。以木聚糖酶活性進行比較，黑曲霉A2＞黑曲霉A1＞其他。根據透明圈的大小、菌絲體生長狀況和所測定酶活的大小，最終確定了黑曲霉A2、青霉A3、綠色木霉A8、PC作為篩選的最終菌株。

本試驗篩選到的4種真菌都是具有纖維素分解能力的菌株。青霉屬(Penicillium)是真菌中的一些不僅能分泌組成齊全、酶活較高的木質纖維素降解酶系,而且具有易培養和生長快的優勢。劉國棟研究顯示，經過比較基因組學分析，斜臥青霉含有種類、數量更為豐富的木質纖維素降解酶編碼基因，尤其是參與半纖維素降解的蛋白和含纖維素結合域蛋白的編碼基因。同時，斜臥青霉基因組織上存在植物細胞壁降解酶編碼基因密集分布的區域，部分木質纖維素降解酶編碼基因可能來自金華中的水平轉移、擴張事件[16]。劉清鋒等在稻田腐爛秸稈中分離到一株青霉，培養基含3%稻草粉、0.25%尿素和無機鹽營養液,最佳產酶條件為：自然pH值，30℃、130 r/min發酵4 d。該菌株的CMC酶活和濾紙酶活最高分別達到45.01 IU/ml和6.89 IU/ml[17]。對黑曲霉的研究較多且全面，黑曲霉纖維素酶各組分均為糖蛋白，但含糖量和組成各不相同，含糖量分別為：β-葡糖苷酶11.3%，內切β-葡聚糖酶11.8%，β-葡聚糖纖維二糖水解酶CBH-Ⅰ17.2%、CBH-Ⅱ5.8%[18]。纖維素酶各組分全面。綠色木霉也是一種常用的發酵秸稈的菌種。林元山等通過單因子及正交試驗,對綠色木霉AS3.5455固體發酵稻草秸稈確定最佳產酶條件為：稻草粉8 g、麩皮4 g，Mendels營養液20 ml、起始pH值5.0,28℃固體發酵3.5 d。在此優化條件下,纖維素酶活力可達0.34 IU/ml[19]。巫小丹等采用PDA-愈創木酚法篩選到1株綠色木霉(Trichoder?ma viride)，在其研究的最佳產酶發酵條件下，CMCase、FPA和β-葡糖苷酶酶活力分別達(2.73±0.08)、(0.95±0.09)、(1.75±0.12)IU/ml[20]。經過對比，本試驗篩選到的青霉、黑曲霉、綠色木霉的酶活性比上述研究的酶活性要低，可能是因為發酵體系的成分、體系中所含的誘導物及發酵條件導致。

3.2 不同真菌組合固態發酵降解玉米秸稈的效果

與木質素降解相關的降解酶主要是Lip、Mnp、Laccase。產木質素降解酶的菌種主要是一些真菌類，其中，白腐菌是目前所發現的一類唯一能夠徹底降解木質素的微生物，它可以分泌木質素過氧化物酶（Lip）、錳過氧化物酶（Mnp）、漆酶（Lac）等胞外酶降解木質素。黃孢原毛平革菌是白腐菌的典型代表。其分泌的木質素降解酶主要為Lip、Mnp,不產Lac。與此同時，在不同的研究中發現，青霉、黑曲霉、綠色木霉也能分泌木質素降解酶。尹璐對簡青霉降解稻草秸稈的研究發現，簡青霉對稻草秸稈降解的大致過程是先對表面蠟質和纖維素、半纖維素進行降解，對木質素進行側鏈氧化和甲基化；然后木質素中的苯環被解鏈，并得到進一步降解[21]。郁紅艷等研究發現，其降解主要發生在Lip與木聚糖酶酶活高產的初級代謝階段，與白腐真菌次級代謝開始降解木質素的作用機制不同，25 d培養可使稻草木質素絕對量損失0.23 g，降解率達14.94%[22]。刁興梅等從農林廢物堆肥中分離得到1株黑曲霉,具有木質素降解能力,兼具低分子量木質素酚型、非酚型類物質的降解能力。在試驗條件下,培養30 d使木質素降解率達16.87%,紅外光譜分析結果表明,稻草木質素結構被破壞,木質素各官能團的降解作用不同[23]。因此，將黃孢原毛平革菌和青霉真菌等進行組合，可以將初級代謝階段和次級代謝階段開始的降解活動進行復合，充分利用各種酶活，增加其降解秸稈的效果。

本試驗中，由計算可知，黃孢原毛平革菌純培養降解玉米秸稈，木質素降解率為29.10%，低于蘆淞等的研究結果[24]。蘇瑞等研究發現，黃孢原毛平革菌降解稻草,木質素、纖維素和半纖維素的降解量分別提高了3.285%、0.304%和2.123%[25]。王麗婷等對大豆秸稈中木質纖維素進行降解，FT?IR檢測后發現，與木質素相關的譜峰(1 099 cm-1、1 057～1 038 cm-1)相對強度減小,與苯環相關的譜峰(1 643～1 608 cm-1、1 510～1 508 cm-1)相對強度增加,表明部分大分子木質素裂解成小分子木質素或木質素單體,對比其他譜峰相對強度的變化發現,木質素中苯環等環狀化合物含量減少[26]。

黑曲霉降解稻草時，降解率最高可達6.20%[27]，明顯低于本試驗的纖維素降解率9.32%。王儀明等利用綠色木霉固態發酵產纖維素酶發酵小麥秸稈后，中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、纖維素含量和半纖維素含量比發酵前分別下降5.22%、6.88%、4.73%和4.16%,木質素含量無明顯變化[28]，其降解率明顯低于本試驗的結果，主要是因為本試驗的試驗材料是玉米秸稈，比小麥秸、稻草秸營養價值高，易于降解。

任克寧等利用白腐菌5.776和黑曲霉3.3148分解玉米秸稈，白腐菌液體菌種和黑曲霉孢子懸浮液的接種比例為5∶1,白腐菌接種2 d后再接入黑曲霉孢子懸浮液,發酵10 d,所得產物中性洗滌纖維的含量為52.07%[29]。比本試驗的白腐菌和黑曲霉組合的中性洗滌纖維含量60.23%要低，可能是所用的玉米秸稈本身的木質纖維素的含量及硅酸鹽的含量不同，導致該真菌組合對玉米秸稈的降解率不高。陳耀寧報道，黃孢原毛平革菌和歧皺青霉混合培養發酵稻草秸后，發酵體系內的微生物產酶更加穩定，峰值維持時間較長，發酵結束時Lip還處于較高水平(52 IU/ml)，約是黃孢純培養時的兩倍，結束時Mnp也比其他純培養的高。同時，半纖維素、纖維素和木質素降解率均比純培養時高，分別為53.1%、52.7%和54.9%[30]，均高于本試驗的半纖維素、纖維素和木質素降解率。

本試驗將黃孢原毛平革菌分別與上述篩選的纖維素分解菌進行組合，測定其在固態發酵條件下的酶活及其降解秸稈的效果。對表5進行分析，PC+黑曲霉+青霉+木霉的木質素含量低于PC、黑曲霉、青霉的純培養發酵，與木霉發酵降解秸稈的木質素含量相差不多；同時表明不同的纖維素降解菌和木質素降解菌簡單的組合在一起，往往達不到滿意的效果，有的組合降解秸稈的效果并不明顯。經過比較，PC+黑曲霉+青霉+木霉是比較理想的組合，Mnp的酶活達到449.58 U/ml,Lip的酶活為5.12 U/ml，纖維素、半纖維素、木質素降解率為29.60%、12.02%、29.10%。

4 結論

本試驗得到了一種能較好降解纖維素和木質素的菌株的組合PC+黑曲霉+青霉+木霉,纖維素、半纖維素、木質素的降解率分別為29.60%、12.02%、29.10%。