■田亞紅 王巍杰 王之爽
(河北聯合大學生命科學學院,河北唐山 063000)
我國向日葵總產量在180~200萬噸[1],與此同時,產生大量的副產物向日葵花盤、秸稈等,其少部分直接用于禽畜飼料,但由于其粗纖維含量較高,動物消化吸收率低,適口性差。如能有效地利用這些資源,將其轉化為可利用的生物蛋白飼料,不僅可以減少向日葵花盤、秸稈等廢棄物對環境的污染,而且能提高飼料的適口性、消化率和利用率,降低飼料成本,具有重要的研究意義。
本文探索了向日葵花盤、秸稈微生物發酵生產生物蛋白飼料的工藝,以期對向日葵花盤、秸稈蛋白飼料化提供理論依據。
1.1.1 原料
將向日葵花盤、秸稈清洗、晾干,混合粉碎過篩(40目)后,備用。
1.1.2 菌種
啤酒酵母、安琪酵母、綠色木霉、乳酸菌、枯草芽孢桿菌由河北聯合大學生命科學學院微生物實驗室提供。
1.1.3 培養基
啤酒酵母、安琪酵母、綠色木霉:PDA培養基。
乳酸菌:MRS培養基[2]。
枯草芽孢桿菌:牛肉膏蛋白胨培養基。
1.1.4 主要儀器
HPX-9082MBE數顯不銹鋼電熱培養箱:上海博訊實業有限公司醫療設備廠;YXQ-280SI型手提式滅菌鍋:上海經濟區嘉興市中新醫療儀器有限公司;TDA-8002電熱恒溫水浴鍋:余姚市東方電工儀器廠;KDN-08C凱氏定氮儀:蘇州宏拓電子有限公司。
1.2.1 向日葵花盤、秸稈生物蛋白飼料的制備工藝流程(見圖1)
圖1 工藝流程
1.2.2 測定方法
粗蛋白含量:采用凱氏定氮法[3]測定;粗纖維含量:采用酸性洗滌劑法[4]測定。
根據向日葵花盤、秸稈發酵對菌種的要求,分別采用啤酒酵母(A)、安琪酵母(B)、綠色木霉(C)、乳酸菌(D)、枯草芽孢桿菌(E)進行單菌發酵試驗,測定發酵產物的粗蛋白含量(見圖2)。
圖2 不同單一菌種發酵對產物粗蛋白含量的影響
由圖2可知,向固體發酵培養基中接入單一菌種,與對照組(CK)相比,均能提高發酵產物的粗蛋白含量。選擇其中發酵產物蛋白含量最高的三株菌,枯草芽孢桿菌(8.33%)、啤酒酵母(7.99%)、綠色木霉(7.84%)作為混合菌種發酵向日葵花盤、秸稈產蛋白飼料。
2.2.1 接種的菌種比例對向日葵花盤、秸稈發酵的影響
分別采用復配比例分別為1∶1∶1,1∶1∶2,1∶2∶1,2∶1∶1,2∶1∶2,2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進行向日葵花盤、秸稈發酵試驗,測定發酵產物的粗蛋白含量(見圖3)。
圖3 菌種不同復配比例對產物粗蛋白含量的影響
從圖3可知,當啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉復配比例為2∶2∶1時,發酵產物的粗蛋白含量最高,為9.75%。其發酵產物有酒香,色澤淡黃,干燥后色澤無大變化。因此,最佳的菌種復配比例是啤酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶綠色木霉為2∶2∶1的混合菌種發酵向日葵花盤、秸稈產蛋白飼料,且混合菌種發酵生產的蛋白質含量優于單菌發酵。
2.2.2 接種量對發酵產物粗蛋白含量的影響
分別采用接種量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的復配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進行向日葵花盤、秸稈發酵試驗,測定發酵產物的粗蛋白含量(見圖4)。
從圖4可知,隨著接種量的增加,發酵產物中粗蛋白產量隨之增加,當接種量為2%時,粗蛋白產量達到最高為11.34%,當接種量繼續增加,粗蛋白產量略有下降,主要是由于接種量過大,營養成分迅速消耗,菌體過早自溶,不利于粗蛋白的產生。
2.2.3 發酵時間對發酵產物粗蛋白含量的影響
采用復配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進行向日葵花盤、秸稈發酵試驗,發酵時間分別12、24、36、48、60 h時,測定發酵產物的粗蛋白含量(見圖5)。
圖4 接種量對產物粗蛋白含量的影響
圖5 發酵時間對產物粗蛋白含量的影響
從圖5可知,隨著發酵時間的延長,粗蛋白含量呈先上升后下降趨勢,當發酵時間為48 h時,粗蛋白含量達到最高,故最佳發酵時間為48 h。
2.2.4 含水量對發酵產物粗蛋白含量的影響
分別調整培養基的含水量為20%、40%、60%、80%,采用復配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進行向日葵花盤、秸稈發酵試驗,測定發酵產物的粗蛋白含量(見圖 6)。
圖6 含水量對產物粗蛋白含量的影響
由圖6可知,隨著培養基水分的增加,產品粗蛋白含量先增加后降低。當基質中初始水分含量為40%時,發酵產品中粗蛋白含量最高。說明此含水量的培養基質最適宜微生物生長繁殖,這可能是因為基質的細小顆粒之間存在合適的疏松度,有利于溶氧和CO2的排出,促進微生物菌體生長,從而使發酵產品中粗蛋白含量增加,因此,適宜的含水量為40%。
2.2.5 培養溫度對發酵產物粗蛋白含量的影響
分別設置培養溫度為25、29、33、37、41 ℃,采用復配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進行向日葵花盤、秸稈發酵試驗,測定發酵產物的粗蛋白含量(見圖7)。
圖7 培養溫度對產物粗蛋白含量的影響
從圖7可以看出,隨著培養溫度的升高,粗蛋白產量呈先上升后下降趨勢。這是由于枯草芽孢桿菌最適溫度為37℃左右,啤酒酵母和綠色木霉的最適溫度為28℃左右,三種菌的最適溫度不是在同一范圍內,因此兼顧到混菌發酵過程,當發酵溫度為33℃,此時的發酵產品中粗蛋白含量最高。
2.2.6 正交實驗結果與分析
綜合考慮上述單因素實驗結果,在上述實驗的基礎上,設計接種量、發酵時間、含水量和培養溫度L9(34)的正交實驗,因素及水平見表1。實驗結果見表2、表3。
由表2直觀分析可以看出,對影響的次序由大到小為A>C>B>D,即接種量>含水量>發酵時間>培養溫度,最佳組合方式為A3B3C2D1。表3方差分析可知,接種量和含水量對產物粗蛋白含量的影響顯著,而發酵時間和培養溫度影響不顯著,與直觀分析結果一致。
表1 正交實驗因素水平
表2 L9(34)正交實驗結果
表3 方差分析
在最優發酵條件下進行三組平行試驗,結果重現性好,發酵產物粗蛋白含量平均為14.35%,優于前述試驗效果,故確定混合菌種發酵向日葵花盤、秸稈產蛋白飼料的最優條件為:接種量2%,發酵時間48 h,含水量50%,培養溫度29℃。
按照上述確定的混合菌種發酵向日葵花盤、秸稈產蛋白飼料的最優條件進行發酵試驗,對發酵產物的粗蛋白和粗纖維含量進行測定,并與未發酵的原料進行對比,測定結果見表4。
表4 發酵飼料與原料中各主要成分比較
由表4可知,原料發酵后,粗蛋白含量由7.45%上升到14.35%,粗蛋白增加率為92.62%。粗纖維素由發酵前的24.95%減少為21.10%,粗纖維減少率為15.43%,說明微生物生長繁殖將部分碳水化合物與無機氮變成菌體蛋白。且發酵產物有酸甜味和酒香味,無霉味,色澤淡黃,適口性好,這樣能在一定程度上使其更好的被飼養動物吸收,更大的發揮向日葵花盤、秸稈的利用價值。
將向日葵花盤、秸稈轉化為蛋白飼料,既可提高其綜合利用價值,又能緩解蛋白飼料短缺所帶來的問題。本研究對向日葵花盤、秸稈轉化為蛋白飼料發酵條件進行了探索,比較了單菌發酵與混菌發酵生產生物蛋白飼料的工藝,結果表明,混合菌種發酵生產的蛋白質含量優于單菌發酵;確定了混合菌種發酵向日葵花盤、秸稈產蛋白飼料的最優條件為:接種量2%,發酵時間48 h,含水量50%,培養溫度29℃,在此條件下,發酵產物粗蛋白由7.45%上升到14.35%,粗蛋白增加率為92.62%,粗纖維素由發酵前的24.95%減少為21.10%,粗纖維減少率為15.43%。