中草藥混菌發酵生產新型生物中藥的研究

■戴 燊 程茂基 韓 信 吳 超 李小燕

（安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036）

眾所周知，抗生素的濫用在我國屢禁不止，但是抗生素的大量長期使用會造成有害菌種的耐藥性及畜產品藥物殘留。食用藥物殘留的畜產品，會使人類產生過敏反應、中毒等危害，并損害身體健康[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，對高品質畜產品的不斷追求，開發安全、綠色、無毒的新型飼料來替代抗生素是當前我國養殖業必須堅持的道路，這也成為時下科研院校單位研究的熱點問題。

自20世紀80年代開始，人們對于中草藥飼料添加劑的研究熱情不減。大量的試驗表明中草藥添加劑不僅能提高生產性能，而且有良好的抗菌作用；中草藥還具毒副作用小、殘留低、無抗藥性等優點[2]。如山茶籽餅（粕）粉中含有豐富的糖萜素，杜仲葉中含有豐富的綠原酸；黃芪中含有豐富的黃芪多糖；松針粉中含有豐富的松針油；淫羊藿中含有豐富的皂甙；甘草中含有豐富的甘草多糖、甘草酸、甘草黃銅。研究表明，這些皂甙、生物堿、植物甾醇和有機酸等活性物質可以明顯提高動物生產性能和免疫力[3-6]。但是中草藥由于植物細胞壁的阻礙作用，使得藥性難得到充分釋放，然而，中草藥經過微生物發酵后，由于植物細胞壁被酶解，大量的活性物質溶出，極大程度地提高了有效成分的含量，如吳志勇等[7]將黃芪發酵，結果可以大大提高黃芪的療效。雖然中草藥發酵技術取得了不少進展,但是目前國內外少數一些中草藥產品或研究仍有不足之處:①產品或研究都是單一的有氧發酵或厭氧發酵，即要么只有氧發酵，要么只采用厭氧發酵，未見有氧和厭氧異步發酵的報道或產品；②飼用發酵與酶解提取中草藥的組方也大多是單一的，缺乏科學的中草藥復合組方發酵產品或研究。③發酵菌種的合理選擇，菌種混合發酵相對單一菌種發酵而言，具有更強的生物轉化能力，選擇合適的發酵菌種，對生物發酵的生產具有重要意義。本研究先采用黑曲霉有氧發酵產纖維素酶、果膠酶等破解植物細胞壁，再用植物乳桿菌厭氧發酵酶解。采用的黑曲霉是經過N+注入經過選育的高產纖維素酶，、果膠酶、蛋白酶等酶的菌株，植物乳桿菌可產生大量的營養因子，維生素以一些促生長因子。發酵中草藥由山茶籽餅（粕）粉、黃芪、山楂、甘草、淫羊藿組成的復方中草藥。通過研究最佳混菌發酵工藝條件下產纖維素酶活、果膠酶的活力大小，以及通過發酵前后營養成分的比較，最終為開發出一種可替代抗生素的綠色、健康、環保的新型生物飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

本實驗室保存的黑曲益生菌株AN03（N+注入誘變選育的高產酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的菌株）、植物乳桿菌ANCLA01。

1.1.2 中草藥組方

山茶籽餅（粕）粉、黃芪、山楂、松針粉、淫羊藿，購自合肥琥珀中藥店。去雜粉碎過80目篩。

1.1.3 黑曲霉斜面培養基

PDA培養基；植物乳桿菌ANCLA01:MRS培養基。

1.1.4 液體種子培養基

PDA培養基（不加瓊脂）；植物乳桿菌AN?CLA01:MRS培養基（不加瓊脂）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基礎培養基的優化

在單因素研究水平的基礎上，采用4因素3水平正交設計試驗，確定最佳培養基。有氧黑曲霉發酵階段溫度30℃、厭氧植物乳桿菌發酵階段溫度為37℃，有氧、厭氧發酵時間比為2∶1，總發酵時間為96 h，接種比例為2%∶2%，pH值為5。研究中草藥濃度，葡萄糖添加量、酵母膏添加量、以及K2HPO4添加量對纖維素酶活、果膠酶活的影響（見表1）。

表1 最佳培養基正交試驗因素與水平

1.2.2 發酵條件的優化

在以上單因素試驗基礎上，確定最佳培養基后,設計4因素3平水正交試驗（見表2），研究有氧厭氧發酵時間比、總發酵時間、接種比例、pH值對混菌發酵的影響，以纖維素酶活、果膠酶活為衡量指標確定混菌發酵的最優條件。

表2 最佳發酵條件正交試驗因素與水平

1.2.3 粗酶液的制取

纖維素酶液的制備：將發酵液用0.45 μm的濾膜過濾，吸取1 ml酶液于一定體積的容量瓶中，用緩沖溶液定容，測定酶活時取一定合適的倍數。

果膠酶液的制備：將發酵液用0.45 μm的濾膜過濾，吸取1 ml酶液于一定體積的容量瓶中，用緩沖溶液定容，測定酶活時取一定合適的倍數。

1.3 測定方法

纖維素酶活測定采用DNS法：在37℃，pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位[8]。

果膠酶活測定采用DNS法：1 g酶液在50℃、pH值為5.0的條件下，1 h分解果膠產生1 mg半乳糖醛酸為一個酶活單位[9]。

粗蛋白測定采用凱氏定氮法；

粗灰分、鈣磷等營養成分參照張麗英[10]《飼料分析及飼料質量檢測技術》的方法檢測；

中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質素測定采用Van Soest法測定。

1.4 數據處理

數據處理與分析使用SAS軟件，進行方差分析與多重比較。

2 結果與分析

2.1 基礎培養基的優化

表3 培養基優化正交試驗結果及極差分析

由表3的正交試驗結果分析可以看出，影響纖維素酶活、果膠酶活力的四個因素的主次順序為：中草藥濃度＞酵母膏添加量＞K2HPO4添加量＞葡萄糖添加量，其中中草藥濃度對兩種酶活的影響有顯著差異（P＜0.05），其他添加量對酶活影響不顯著(P＞0.05)。當中草藥濃度過大時，中草藥液中的物質對菌種的產酶有一定的抑制作用。表3可以看出，最佳發酵濃度為10%。從表3可以看出最優組合為A2B1C1D1，即中草藥濃度為10%，葡萄糖添加量為1%，酵母膏添加量為0.2%，K2HPO4添加量為0.1%時，產纖維素酶活和果膠酶酶活力最高，由于表中并沒有這個組合,因此對該最優水平進行分析驗證，測得在此條件下纖維素酶活達到1 398.5 U/ml，果膠酶活達到1 259.3 U/ml。因此，確定基礎培養基：中草藥濃度為10%,葡萄糖添加量為1%,酵母膏添加量為0.2%，K2HPO4添加量為0.1%。

2.2 最佳發酵條件的優化（見表4）

表4 培養條件優化正交試驗結果及方差分析

由表4的正交試驗結果分析可以看出，影響纖維素酶活、果膠酶活的四個因素的主次順序為好氧厭氧時間比例＞總發酵時間＞接種比例＞pH值，其中好氧厭氧時間比例、總發酵時間對兩種酶活的影響差異極顯著（P＜0.01）,接種比例差異顯著（P＜0.05），pH值對產酶的影響不顯著(P＞0.05)。好氧厭氧時間比例低，好氧時間短，影響黑曲霉的生長繁殖，因而分泌的酶量較低，好氧厭氧發酵時間比例相等時，黑曲霉的發酵時間也相對較短，因而產生的酶量也少?？偘l酵時間過長過短對兩種酶活的影響都很大，發酵時間過短不利于菌種的生長繁殖，發酵時間過長，營養物質消耗過多，菌種生產環境惡化，對發酵也造成不利影響。在此表中，可以看出最優發酵條件組合是A3B2C2D1，即好氧厭氧發酵時間比為2∶1，總發酵時間為96 h，接種量比例為2%∶2%，pH值為5時，由于表中沒有此組合，因此對該最優水平試驗分析，測得此條件下纖維素酶活達到1 412.3 U/ml,果膠酶活達到1 287.5 U/ml。由此，確定發酵條件為：好氧厭氧發酵時間比為2∶1，總發酵時間為96 h，接種量比例為2%∶2%，pH值為5。

2.3 發酵前后營養成分的變化

由表5中試驗結果可知，中草藥經混菌發酵，粗蛋白由發酵前的11.35%提高到14.89%，提高了31.19%，粗脂肪提高了59.11%，Ca、P含量分別提高了50%、85.71%，中性洗滌纖維，酸性洗滌纖維，木質素分別降解了24.21%、12.58%、17.56%。營養價值有了明顯的提高。

表5 發酵前后營養成分對比（%）

3 討論

3.1 微生物的生長繁殖需要適宜的滲透壓環境，菌體的正常繁殖速率，在通常情況下與底物的培養基的濃度成線性關系，但是，底物濃度過高，培養基的粘度必然增加，影響到培養基的滲透壓和溶氧，對微生物生長反而不利。而且，培養基過于豐富，有時會使菌體生長過盛，發酵液非常粘稠，使得傳質狀況變差，不利于產物的合成[11]。因此.必須選擇合適的底物濃度。本試驗中發酵培養基的最適底物濃度為10%，這與韓春楊[12]的研究報道一致。

好氧厭氧發酵時間過低或者相等時，好氧黑曲霉沒有足夠的時間產生足夠量的纖維素酶、果膠酶等，因而合適的好氧厭氧發酵時間比例對酶活的產量有極顯著的影響?？偘l酵時間過短不利于菌種的正常生長繁殖；而時間過長，有機營養物質被大量消耗，影響培養基的滲透壓和溶氧，對發酵反而不利，本試驗選用總發酵時間為96 h，這與朱平軍的研究報道一致[13]。

合適的接種比例對產酶量也有顯著的影響，接種量比例不均不利于有益菌的正常繁殖，還可能產生競爭關系，反而影響產酶量，本試驗兩種菌的接種比例為2%∶2%。

pH值是影響菌種正常生長繁殖的因素之一，本實驗的最適產量pH值為5，這可能因為一方面在此pH值時，有利于有益菌種的正常繁殖，另一方面抑制了其他雜菌的正常繁殖。

3.2 中草藥經混菌發酵后，其營養價值有了明顯的提高，尤其是極大的降解了纖維素含量，從而破解了大量的細胞壁，使得藥物活性更大地釋放出來，提高了中草藥的綜合利用價值，本試驗采用的是經過N+注入誘變選育的高產酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的黑曲霉菌株以及植物乳桿菌ANCLA01。此兩種菌種的好氧與厭氧混菌發酵對酶量的高產有功不可沒的作用。

4 結論

4.1 本試驗先采用黑曲霉有氧發酵，再用植物乳桿菌厭氧發酵，生產新型生物中藥，最佳培養基條件為中草藥濃度為10%，葡萄糖添加量為1%,酵母膏添加量為0.2%，K2HPO4添加量為0.1%，有氧發酵溫度為30℃，厭氧發酵溫度為37℃，好氧厭氧發酵時間比為2∶1，總發酵時間為96 h，接種量比例為2%∶2%，pH值為5。在比條件下纖維素酶活達到1 412.3 U/ml，果膠酶活達到1 287.5 U/ml。

4.2 中草藥經混菌發酵后，粗蛋白由發酵前的11.35%提高到14.89%，提高了31.19%，粗脂肪提高了59.11%，Ca、P含量分別提高了50%、85.71%，中性洗滌纖維，酸性洗滌纖維，木質素分別降解了24.21%、24 12.58%、17.56%。營養價值有了明顯的提高。