Sihler’s 神經染色法再改良在中空器官中的應用

李 艷，黃小勇，鄧義波，黃 建，陳道邦 (四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川成都610041)

隨著現代微創外科的發展，醫生越來越重視術后病人的生活質量，如何才能在手術中盡可能地保留手術部位殘留器官的功能以及減少相關并發癥的發生是醫生十分關注的問題。因此對器官壁內神經分布的了解有了更多的要求。一般對器官神經支配的研究是采用大體和顯微外科解剖的方法，可以粗略顯示神經在肌內分布情況，但是隨著神經的不斷分支，神經纖維越來越細小，變得難以與血管和結締組織區別［1］。自從19 世紀 Charles Sihler 采用 Sihler’s 神經染色法進行完整肌內神經研究以來，經過學者的不斷改良［2-4］，到目前為止被認為是完整肌內神經分支分布研究優先選擇的方法，主要應用于研究哺乳動物的骨骼肌。楊勝波等［5］用該法研究了人胃壁內迷走神經的分布;趙澤駒等［6］用該法研究了人膀胱肌內的神經支配及分布，認為Sihler’s 神經染色法也適用于研究平滑肌肌內神經的分布。但是在研究迷走神經的實驗過程中沿胃大彎側切開胃，研究膀胱壁內神經時自膀胱尖沿膀胱長軸縱行剪開膀胱前壁，這些切開破壞了器官結構的整體性，有可能破壞神經在切開區域的分布，且染色效果不好。本實驗中在不切開中空器官的情況下應用再改良的Sihler’s 染色法完整清晰顯示了神經在器官壁內的分布以補充解剖學的資料，為臨床應用提供依據，也為以后研究中空器官提供一定的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以合法途徑取得人食管標本15 例，胃標本15 例，膀胱標本15 例。從舌骨平面到十二指腸上部取食管和胃，保留食管兩側的組織結構;切取膀胱并保留雙側輸尿管盆段約4 cm。生理鹽水沖洗，10%福爾馬林常溫固定6 周。

1.2 再改良的Sihler’s 肌內神經染色法

1.2.1 除色素 組織固定后用流水沖洗至無甲醛味，約10 h。沖洗胃、食管時可以從胃幽門處插乳膠管，沖洗膀胱時可以從尿道內口插入帶有特制玻璃管的乳膠管，緩慢沖洗胃、食管、膀胱內壁，水從食管端、輸尿管端流出。為了加快沖洗膀胱壁可在膀胱壁上插入兩個5 號針頭以便水流出。然后用3%KOH 加3% H2O2溶液灌入胃、食管、膀胱內，除色素，液體變渾濁后及時更換，并隨時觀察標本中神經在器官壁內變化，此過程約需 3 ～ 4 周。

1.2.2 脫鈣 標本置于流水下沖洗 30 min，浸入 Sihler’sⅠ溶液進行脫鈣，在胃、食管、膀胱內灌入脫鈣液，約每4 d 換脫鈣液1 次。需要3 周左右至透明。

1.2.3 染色 脫鈣后的標本在流水下沖洗30 min，在胃、食管、膀胱內灌入染色液，浸入Sihler’sⅡ溶液染色，每1 ～2 周換染色液1 次，直至肌內神經染色為止，此過程需2 ～3 周。

1.2.4 脫色 將染好色的標本置于流水下沖洗30 min，然后將標本放入酸性分化液(由1 份鹽酸，100 份70%酒精溶液配制而成)進行脫色，隨時在X 線片閱片箱下觀察肌內神經與肌肉顏色的對比度，直到肌內神經顯示紫藍色，肌肉呈棕紅色為止。此過程時間視標本大小及肌肉厚度而不同。再次改良的方法不需要中和，脫色完畢后只需置于流水下沖洗30 min。

1.2.5 透明 剔除筋膜，然后將標本依次放入40%、60%、80%、100%梯度甘油中進行透明，及時更換甘油。每個梯度透明3 d，透明過程中注意觀察，進行輕輕攪拌以透明均勻。避光保存在加入少許麝香草酚的100%甘油中。在X 線片閱片箱下仔細觀察肌內神經與血管的分支分布，照相。

2 結果

2.1 迷走神經在食管的分布

經染色處理后的食管成透明膠凍狀，迷走神經在食管壁內的走行清晰可見(圖1)。食管上段前壁神經分支鮮見，后壁左右兩側均有迷走神經分支穿入，且兩側的神經分支之間有聯系，吻合成不規則的多邊形。兩側的迷走神經在食管中下段的前、后壁形成豐富的神經叢。右迷走神經發出分支形成食管后叢，部分神經纖維與左側迷走神經形成食管前叢。左側迷走神經分出的分支主要形成食管前叢，部分神經纖維參與右側迷走神經形成食管后叢。

圖1 食管壁迷走神經的分布及分支間的聯系

2.2 胃迷走神經的分支分布

染色后的胃成透明膠凍狀，神經分支較細小，有胃底支、胃體支、幽門前支、幽門后支。分支間在臨近胃小彎1/3 處開始有分支，向胃大彎發出各級分支，呈扇形分支分布，且分支間有吻合聯系。在胃大彎側胃前支和胃后支有吻合(圖2)。

圖2 胃迷走神經的分支分布

2.3 膀胱壁內神經的分支分布

染色后的膀胱成透明狀，在左右輸尿管附近有較多的神經分布，向前下走行，沿途發出分支，分支間有交叉連接，支配膀胱兩側面及膀胱尖。右側輸尿管附近神經較左側多。左右輸尿管口之間有較多的神經纖維分布，神經纖維向前延伸(圖3)。膀胱三角區神經密集，是否和膀胱三角區一些疾病的發生存在聯系，有待進一步研究。膀胱前壁神經分布較少。

圖3 膀胱壁內神經的分支分布

3 討論

Sihler’s 染色法是目前研究骨骼肌內神經分布的優先選擇方法，從實驗結果可以看出，此法不僅適用于骨骼肌肌內神經的染色，同樣適用于平滑肌肌內神經的染色。雖然楊勝波、趙澤駒等［5-6］用該法研究了胃和膀胱壁內的神經分布，但是都不同程度地破壞了器官的完整性?，F就Sihler’s 神經染色法在空腔器官中的應用以及筆者在實驗中的一些經驗加以討論。

3.1 關于空腔器官的固定

王林波等［7］在消化道腫瘤切緣伸縮性的研究中指出:空腔器官離體后就有不同程度的回縮，切除標本離體后食管回縮44.5%、胃回縮13.6%。標本在固定的過程中又有一定的回縮，不同的器官回縮率不等，以固定后6 ～8 h 回縮率明顯，超過12 h 后標本基本不再回縮。因此在固定空腔器官時，應當把空腔器官內腔用生理鹽水沖洗干凈，在腔內灌入適量固定劑使空腔器官處于適當充盈狀態以維持器官的正常形態。固定1周后固定液渾濁要更換固定液。

3.2 器官的除色素

在用流水沖洗的過程中，為了加快甲醛被沖洗去除的速度，可以在空腔器官內放置連有特制玻璃管的乳膠管。沖洗后向空腔內灌入適量除色素的液體以加快除色素的速度和保證除色素內外壁均勻。不需要切開空腔器官以保證器官的完整性。在除色素的過程中器官組織會變軟，組織間隙也會增大，因此每次換液時操作要輕柔以免折斷在器官外的神經干。

3.3 除鈣和染色

在除鈣和染色的過程中，每次流水沖洗時都應該沖洗器官的內壁，除鈣液和染色液都要適量灌入空腔器官內以達到器官除鈣和染色均勻。由于空腔器官軟化后體積增大，壁變薄，在X 線片閱片箱上觀察時器官也應灌入適量相應的液體，以免空腔器官前后壁重疊，影響觀察效果。

3.4 脫色與透明

在脫色的過程中，器官腔內灌入適量脫色液使壁內、壁外同時脫色，脫色過程中，標本放在適當的容器內在搖床上震蕩以脫色均勻。據實驗觀察發現:支配空腔器官壁內的神經相對細小。在脫色的過程中要不斷觀察，及時終止脫色過程以防脫色過度。使用的酸性分化液脫色快，其中含有的70%酒精具有部分脫水作用，脫色的過程中有透明效果，脫色后就可以看到神經之間的細小分支。透明過程中，不同梯度濃度的甘油適量灌入器官腔內增加透明的速度，標本完全浸泡在甘油溶液中。標本在低濃度的甘油溶液中會有部分脫色，注意觀察，適當縮短標本在低濃度甘油溶液中的時間。拍照時，避免器官壁重疊，在器官腔內灌入適量100%的甘油。

國內外學者應用Sihler’s 染色法對骨骼肌進行了大量的研究，但該方法本身也有局限性［8］。其優點首先是，Sihler’s 染色法能在不切開或者不對標本切片的條件下，在完整的標本上觀察到細小神經。其次，可以顯示神經分支之間的聯系。再者，整體染色不需要切片，能夠清楚顯示相鄰結構之間的毗鄰關系?？梢酝瑫r觀察到內在神經和動脈血管。Sihler’s 染色法還是存在一定的局限:①不能區分運動神經元和感覺神經元，只是選擇性的使包繞神經軸突的髓鞘著色，神經種類的辨別只能追蹤到穿入標本的神經干。②與其他實驗方法相比，該方法十分費時，并且成功與否與實驗者的經驗相關。每一步驟的終止都依賴于實驗者的經驗。③由于是整體標本的染色方法，染色的質量會隨著標本的大小和肌肉厚薄的不同而有差異。王啟明等［9］通過對 Sihler’s 染色法中固定、脫色、除鈣、透明這幾個步驟改良，研究家兔不同形態肌的神經分布，得出再改良后的Sihler’s 肌內神經染色法較再改良前更省時、更經濟、更實用。但是總體來看整個染色過程還是較長。

隨著修復重建外科以及微創外科等相關學科的發展，對肌內和中空器官壁內神經分支分布有了更高的要求，Sihler’s 染色技術的開展可以指導選擇和切取部分肌肉用作移植，盡最大可能地減少肌肉內的神經損傷，保證肌肉移植后具有正常的神經支配，以重建其運動功能，盡可能地保留供區的各項功能。1964 年Nielsen［10］指出:迷走神經切斷治療十二指腸潰瘍可以引起膽結石的形成，同時胰腺的降低分泌反應，失去胰島素反應，小腸擴張，腸絨毛減少，脂肪的吸收降低。研究中空器官壁內的神經分支分布有助于臨床工作中對中空器官手術入路和手術方式的選擇，最大限度地保護手術區器官功能，同時保留與相鄰器官之間的功能關系。本文認為Sihler’s 染色法的進一步應用和改良尚需要深入探索。

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［9］王啟明，薛 黔，楊勝波.Sihler’s 肌內神經染色法的再改良［J］.遵義醫學院學報，2003，26(4):322 -324.

［10］Nielsen JR.The development of cholelithiasis following vagotomy［J］.Am J Dig Dis，1964，9:506 -508.