微波對老化甜菜種子萌發和早期碳氮代謝的影響

吳旭紅，段政羽

（齊齊哈爾大學生命科學與農林學院,黑龍江齊齊哈爾161006）

微波對老化甜菜種子萌發和早期碳氮代謝的影響

吳旭紅，段政羽

（齊齊哈爾大學生命科學與農林學院,黑龍江齊齊哈爾161006）

采用2450MHz頻率，以不同時間和功率的微波對老化甜菜種子進行預處理，比較了不同處理劑量對其種子萌發及早期碳、氮代謝的影響。結果表明，微波能不同程度地影響老化甜菜種子的發芽狀況及早期代謝中的物質轉化，其影響強度因微波處理時間不同而異，呈現出明顯的劑量效應和微波調控植物代謝的雙重作用。低劑量（90W、20s）處理對芽長、芽活力指數、蛋白水解酶活力及游離氨基酸總量起促進作用（P＜0.05）；中等劑量（270W、10s）處理，種子發芽率、芽長、芽活力指數、可溶糖、可溶蛋白含量及淀粉酶活性在處理與對照之間及各處理之間差異顯著（P＜0.01）；高功率（450W）則隨微波輻射時間的延長，種子活力及萌芽內物質轉化能力均呈下降趨勢。說明適宜劑量的微波輻射，提高了老化甜菜種子的生理生化代謝機能。綜合評價270W 10s不僅加速了原有儲存物質的水解，而且促進早期的合成代謝，為形態建成奠定了基礎，為促進老化種子萌發和早期發育的最佳處理。

老化甜菜種子；微波；氨基酸總量；酶活性；可溶性糖；可溶性蛋白

甜菜作為我國北方工業制糖的重要原料,其產量和含糖率的高低與品種種性和種子質量密切相關。由于甜菜起源于歐洲西部和南部沿海,在長期的馴化過程中形成了喜溫涼的生物學特性。在我國主要分布在北緯40°以北的地區。在內蒙古、黑龍江、新疆及甘肅、寧夏等部分主產區具有明顯的早春氣溫偏低并易發生倒春寒的氣候特點,對甜菜的早期發育尤其是老化甜菜種子的萌發造成抑制,成為幼苗早發和全苗、壯苗的限制因素。

種子預處理是提高種子活力的有效途徑。包括物理方法：如水分、溫度及化學方法如水楊酸、氯化膽堿等。近年來,常作為信息傳遞而用于雷達和通訊技術中的“超高頻電磁波”—微波,其生物效應日益顯現。郝曜山、楊利艷采用2450MHz頻率,以不同功率和時間組合的微波對小麥種子進行預處理,比較了不同處理對小麥種子萌發及幼苗生長的影響,得到了適宜功率不僅對種子萌發起促進作用（—短期效應）,而且還對幼苗生長、生化代謝和生物量的積累產生影響（—長期效應）的結論[1]；申志英等利用微波輻射對幾種藥用植物種子的萌發狀況進行了研究,發現適量微波輻射不僅能不同程度解除種子休眠狀態、提高芽率,且能縮短發芽天數,增加芽的生長速度[2]；陳怡平等對微波處理菘藍種子的子葉發育與生物光子輻射的相關性研究表明,低劑量微波輻射促進了種子生理生化代謝機能,提高了種子的萌發率[3]；相關的研究在水稻、大豆等種子萌發的影響上也已見報道[4-5],但對甜菜種子萌發的生物學效應卻未見相關研究。本文以不同微波功率和輻射時間為交互因子,研究其對老化甜菜種子早期代謝的影響,探索提高高緯地區直播甜菜老化種子活力、促進早期發育的可行性途徑。

1 材料與方法

1.1材料

甜菜（Beta vulgaris L.）品種為德國KWS9419,為2007年由齊齊哈爾市種子經銷處提供,常溫下儲于實驗室內自然老化的種子。微波源為日本松下NN-K597WS型微波爐,功率為80～900W,頻率為2450MHz。

1.2方法

1.2.1 微波處理取籽粒飽滿大小一致的甜菜種子,先用70%的酒精消毒1min,再用5%的次氯酸鈣溶液浸泡2h后,用無菌水沖洗干凈,在常溫下再用ddH2O浸泡10h。濾去水分將種子表面自然晾干后,將供試種子分成12組,每組50粒,分別進行90W、270W、450W,5s、10s、15s、20s輻射處理,以不做輻射為對照,每個處理設3個重復。

1.2.2 種子萌發實驗及生理指標的測定種子萌發采用砂床發芽法。將處理過的甜菜種子播于細砂經清水浸泡1h,高溫滅菌（130℃,3h）定量稱重的培養皿中（50粒/皿）（D=12cm）,等量補充1/8 Hongland營養液至細砂濕潤,置于人工氣候培養箱中（25℃/20℃±1℃,光照10h、黑暗14h循環）發芽。每隔2d以1/8 Hongland營養液補充失水,每天記載發芽粒數,以5d累計發芽粒數為發芽勢,以10d累計發芽粒數為發芽率。每24h進行記錄,對萌發期的形態指標進行統計分析[6-7]。按張志良（1990）的方法測定蛋白質含量,可溶性糖的測定采用蒽酮比色法[8]。參照郭勇（1996）的方法測定氨基酸總量[9]。蛋白水解酶活性測定參見參考文獻［10］。以上測定均采用3次重復,取平均值。

2 實驗結果

2.1微波處理對老化甜菜種子活力的影響

由表1可見,90～270W范圍內,10s、15s及90W的20s微波處理對發芽率的提高均有較大的刺激作用。經t檢驗比較后表明,90W各處理之間差異不顯著（P＜0.05）,但15～20s處理分別比對照高24.0%、22.5%,均達到差異顯著水平；270W10s、15s輻射發芽率分別是對照的1.31倍和1.60倍,處理之間及處理與對照之間達差異極顯著水平（P＜0.01）；450W 5s處理比對照高42.6%（P＜0.01）,此后隨著處理時間的延長,發芽率呈明顯下降的趨勢,15s、20s處理分別比5s降低了45.49%、56.80%,僅為對照的77.74%、61.61%,但10s處理仍比對照高11.7%,已呈現出不同劑量的微波處理刺激和抑制種子萌發的雙面效應。

表1 微波處理對老化甜菜種子活力的影響

90W 20s與270W 10s、15s處理顯著促進了甜菜下胚軸的伸長。與對照比較,分別是對照的1.57倍、1.64倍、1.95倍。450W處理除20s芽長低于對照外,其余各處理均高于對照,但處理與對照之間及各處理間差異不顯著（P＜0.01）。

除270W 20s和450W 15s、20s外,各處理均使老化甜菜種子發芽指數有所提高。90W處理5s發芽指數與對照持平,10s、15s兩處理間無差異（P＜0.01）,但與對照之間差異顯著（P＜0.05）,20s處理發芽指數比對照高39.84%,已為對照的1.40倍。270W處理發芽指數的峰值出現在10s,此后迅速下降,20s處理僅為對照的87.76%。450W處理5s發芽指數是對照的1.25倍,10s與對照持平,15～20s發芽指數急劇下降,20s處理發芽指數僅為對照的64.84%。

發芽指數和活力指數是衡量種子發芽和整齊度的重要指標。90～270W范圍內,5～15s處理隨處理時間的延長和功率的加大活力指數加大,峰值出現在270W 10s和90W 20s。450W處理5～10s仍比對照高16.48%和8.05%,15～20s處理發芽指數降至對照以下。

從形態指標的分析表明,微波對老化甜菜種子發芽率、芽長、發芽指數及芽活力指數均有很大影響。適宜微波功率和處理時間組合的微波劑量能刺激萌發過程,加速種子內的物質轉化,使萌發速度加快,時間縮短。但隨處理劑量加大,各形態指標又呈下降趨勢。

2.2微波處理對老化甜菜種子萌發期淀粉酶活性和可溶性糖含量的影響

圖1 微波處理對老化甜菜種子萌芽可溶糖含量及淀粉酶活性的影響

如圖1（a）所示,老化甜菜種子經90W微波處理后,其萌芽中各處理間可溶糖含量無明顯變化,即處理間差異不顯著（P＜0.05）,但與對照比較均加大,5s和20s分別比對照增加了29.45%、39.73%（P＜0.01）；270W處理5～10s可溶糖隨處理時間的延長而增高,15s時仍維持較高水平,但已呈下降趨勢,20s時可溶糖含量已降至270W10s的68.0%。10s、15s處理與其他處理之間達到差異顯著水平（P＜0.05）,各處理與對照之間均達到差異極顯著水平（P＜0.01）；450W的各處理隨輻射時間的延長,可溶糖呈下降趨勢。5s處理可溶糖是對照的1.95倍,10s仍比對照高34.93%,但15～20s已降至對照的95.2%、87.67%。5～10s范圍內90～270W各輻射處理都促進了老化甜菜種子萌發階段可溶糖的轉化生成,15～20s處理可溶糖已降至對照以下,呈現出較強的抑制作用。說明在安全劑量范圍內,微波處理可迅速激活體內碳素代謝相關酶活性,加速了儲存多糖的水解轉化。但微波劑量效應超過甜菜種子耐受時,由于熱效應的累積,可能導致體內酶活力的降低,使甜菜種子早期糖代謝受阻。同時也表明微波處理具有明顯的安全邊際效應。

不同劑量的微波預處理對萌芽中淀粉酶活性有很大影響,見圖1（b）。90W處理老化種子內淀粉酶活力隨處理時間的延長而增加,15s和20s時分別比對照增加了22.26%、32.88%；270W處理淀粉酶活性呈先升后降的趨勢,峰值出現在處理時間為10s,酶活力已達對照的1.85倍,此后下降,20s時酶活力仍為對照的105.23%,但比10s處理降低了43.07%。該劑量在處理之間及處理與對照之間均達到差異顯著水平（P＜0.01）；450W處理隨輻射時間延長淀粉酶活性逐漸下降,但5～10s處理酶活仍顯著高于對照（P＜0.05）,15s時酶活出現驟降,20s時酶活力僅為對照的64.92%。

淀粉酶和可溶糖變化趨勢表明,適宜強度的微波處理,增強了老化甜菜種子萌發期碳素代謝過程重要的酶活性,促進了物質轉化,為早期發育中器官建成奠定了物質基礎。

2.3微波處理對甜菜萌芽蛋白水解酶活性、可溶性蛋白及氨基酸總量的影響

蛋白水解酶活性在90W時隨輻射時間的延長增加,5～10s酶活增幅緩慢（見圖2）,10s處理僅比對照提高了14.71%,15s處理酶活力急劇增強,20s處理出現酶活力峰值,已達對照的2.41倍；270W處理5～15s范圍內,蛋白水解酶活力隨處理時間延長大幅上升,到達15s時,升幅減小,而此時酶活比對照增加了108.82%,20s處理有所下降,但仍然是對照的1.74倍。無論是處理之間還是處理與對照之間均達到差異顯著水平（P＜0.01）；450W各處理隨輻射時間增長酶活呈明顯的下降趨勢,且在15～20s時急劇降低,僅為對照的102.94%、76.47%。相同處理時間比較,5s內酶活呈現隨功率加大而增加的趨勢,450W處理的酶活為對照的2.03倍,分別比270W、90W處理提高了50.0%、122.58%；10～15s處理酶活都呈現隨功率加大先升后降,且共同點為270W較90W比升幅都超過了24.56%,不同點為10s處理450W降幅較小16.18%,而15s處理酶活則驟降50.70%,微波處理的負效應已顯現和加強,20s預處理酶活力隨功率增加大幅度下降（450W僅為90W的31.71%）也進一步印證了微波生物效應的雙重性。

圖3（a）顯示,經微波輻射后各處理的氨基酸總量均高于對照。其中90W 20s、270W 5s處理分別比相同時間的其他處理提高了40.43%、131.10%、97.95%、36.22%,是對照的2.47、2.85倍。90W各處理10s氨基酸總量略有下降,整體趨勢呈現隨處理時間增長氨基酸總量持續增高,20s時達到峰值（處理內）,5～15s處理間差異不顯著（P＜0.05）,但各處理與對照之間差異顯著（P＜0.01）。270W處理繼峰值出現后,10～15s處理氨基酸總量水平穩定,20s處理明顯下降。450W處理達10s時,氨基酸總量急劇下降,20s處理已降至5s的51.10%,但各處理仍高于對照。說明隨著蛋白水解酶活性的增強,甜菜萌芽中游離氨基酸庫容在加大。

圖2 微波處理老化甜菜種子萌芽蛋白質水解酶的活性

圖3 微波處理對老化甜菜種子萌芽氨基酸總量及蛋白質含量的影響

在輻射劑量組合中,相同處理時間不同處理功率比較,可溶性蛋白含量都表現出先升后降趨勢。相同處理功率不同處理時間條件下,除5s處理外,其他供試樣品均表現為隨處理時間的延長可溶性蛋白含量呈下降的態勢。除270W 10s和450W 5s比對照高12.82%、6.41%外,各處理的可溶性蛋白含量均低于對照,90W、450W 15s處理可溶性蛋白含量僅為對照的69.23%、56.41%,90W、270W 5s比對照降低了16.67%、11.54%?？扇苄缘鞍缀康淖兓砻?隨著甜菜種子萌發,尤其是處理劑量的加大,可溶性蛋白含量與氨基酸總量的變化之間呈一定的負相關性?？赡茉驗?在適宜強度微波刺激下,加速了種子的早期代謝,使蛋白水解酶活性增強,加速了種子內儲存蛋白的降解,因而使溶解狀態的氨基酸含量大幅升高（90W 20s、270W 5s）。90W、450W處理蛋白水解酶活力最大值與氨基酸總量峰值疊加,而270W處理則分別出現在15s和5s。

隨著蛋白水解酶活性的增強,90W10～20s可溶性蛋白含量逐漸減少,且各處理都低于對照,兩者之間呈現負相關；而270W處理,可溶性蛋白含量比蛋白水解酶活性峰值提前（分別出現在10s、15s）；450W蛋白水解酶活性和可溶性蛋白含量兩者之間并未呈現同步效應。

3 結論與討論

甜菜種子的自然老化是一個非常復雜的過程,不僅包含眾多的酶促生化過程,同時由于其長期儲存在含水量低的環境中,非酶促的美拉德反應在種子衰老過程中發揮著更加重要的作用。美拉德反應是還原糖與游離氨基酸的α-氨基或蛋白質N-端氨基形成Shiff堿,進而糖酰類中間物進一步反應生成更復雜糖基化大分子聚合物的過程[11]。衰老的種子萌發期胚軸中美拉德產物增加,而美拉德產物的增加又與糖分的水解和可溶性蛋白合成能力的下降及過度消耗密切相關,從而導致可溶性糖、可溶性蛋白含量下降。

微波是頻率為300MHz～300kMHz的電磁波,具有強穿透性、非電離性,可以深入到被輻射物質內部。當量子能量適中時,與被輻射物質相互作用,只改變其內部物質運動狀態,并不破壞分子結構和維系該結構的作用力。本實驗中,3種功率4個時間組合的微波劑量,其中低劑量90W對發芽率無影響,但20s處理時間時,顯著提高了芽長和芽活力指數及蛋白水解酶活力；中等強度270W處理10s,對發芽指數和芽活力指數的促進作用大于對發芽率和芽長的影響,對淀粉酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白含量的提高最為顯著。15s時對發芽率、芽長、活力指數及蛋白水解酶活性都達到了極顯著的促進作用。高劑量450W處理5s蛋白水解酶活力和可溶性蛋白含量變化顯示,可能提前啟動了氮代謝,不僅使儲存蛋白的轉化加強,同時也提高了蛋白質的早期合成能力。以上結果顯示,微波對老化甜菜種子萌發的影響存在明顯的劑量效應。這種低能電磁輻射劑量偏低,未能達到改變種子內部物質運動狀態從而激發其活力的作用；適宜強度的輻射處理,引發了種子內部強烈的生物響應,使種子內器官分化和發育的物質轉化和生化代謝加速；而高劑量處理則作為逆境,可能使膜脂過氧化作用加劇,電解質滲漏加強,從而使萌發期的物質代謝紊亂。也有可能在高功率下隨輻射時間的延長,使分子內震蕩加劇,破壞了維系生物大分子高級結構的次級鍵,使分子結構破壞,抑制了種子萌發。

在設定處理組合內,270W微波處理10～15s提高了淀粉酶活力及可溶性糖、蛋白質含量和氨基酸總量,很可能是微波熱效應刺激誘導機體產生了熱激響應（heatshock response,HSR）,導致轉錄調節因子激活了熱激基因的表達。同時由于微波預處理增強了蛋白水解酶的活性,提高了氨基酸總量,提前啟動了萌發的代謝過程,促進了組織器官分化,促進了苗期的發育進程。

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Effects of Microwave Pretreatment on Germination of Aging Beet Seed and Carbon and Nitrogen Metabolism in Early Stage Seedlings

WU Xu-hong,DUAN Zheng-yu

(Life Sciences&Farming and Forestry College,Qiqihaer University,Qiqihaer,Heilongjiang 161006,China)

In present study,seeds of aging beet were exposed to microwave irradiation(240 MHz frequency)in different time length and power.Seed germination and early stage carbon and nitrogen metabolism parameters were recorded and compared for seeds treated with different doses.The results showed that microwave pretreatment affected aging beet seeds germination and resources conversion in early stage metabolism to various degrees according to different time length of microwave radiation.Dual functions of dosage effect and regulation and control of plant metabolism by microwave have been revealed.Seedling length,vigor index,proteolytic enzyme activity and total free amino acid increased under low dosage treatment(90 W,20 s)(P＜0.05);Rate of seed germination,Seedling length,vigor index,soluble sugar,soluble protein concentration and activity of amylase showed significant difference not only between treatment and control,but also between each treatment (P＜0.01)under moderate doses(270 W,10 s);Pretreatment with 450W power decreased both seed vigor and resources conversion capabilities following the extension of microwave radiation time.The results demonstrated that physiological and biochemical metabolism of aging beet seed have been improved after treatment with appropriate dose of microwave radiation.Pretreatment dose of 270 W 10s not only accelerated the hydrolysis of the reservoir matter,but also promoted early synthetic metabolism,laid the foundation for the morphogenesis,and therefore is the besttreatmentto promote aging seed germination and early seedling development.

aging beet seed；microwave；amino acid content；enzyme activity；soluble sugar；soluble protein

S566.301

：A

1007-2624（2013）02-0017-04

2012-12-13

吳旭紅（1962-）,女,黑龍江省齊齊哈爾市人,齊齊哈爾大學生命科學與農林學院教授。