二次回歸中心組合法優化外源纖維素酶酶解提取香草蘭青豆莢香蘭素工藝

莫麗梅，張彥軍，谷風林,3，徐 飛，陸敏泉,*

(1.海南大學食品學院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；3.農業部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，海南 萬寧 571533)

二次回歸中心組合法優化外源纖維素酶酶解提取香草蘭青豆莢香蘭素工藝

莫麗梅1，張彥軍2，谷風林2,3，徐 飛2，陸敏泉2,*

(1.海南大學食品學院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；3.農業部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，海南 萬寧 571533)

為優化纖維素酶酶解天然香草蘭青豆莢工藝，本實驗采用二次回歸中心組合方法考察外源添加纖維素酶處理對香草蘭青豆莢香蘭素含量的影響。結果表明：最佳酶解工藝條件為香草蘭青豆莢10g、酶解溫度53℃、纖維素酶添加量26.9mg、酶解時間16h，此條件下天然香草蘭青豆莢中香蘭素含量為2.18%，相比于傳統發酵乙醇回流提取法的1.97%，香蘭素含量提高0.21%。

香蘭素；纖維素酶；條件優化

香草蘭(Vanilla planifolia Andrews)又名香莢蘭、香子蘭、香果蘭，屬蘭科(Orchidaceae)香子蘭屬多年生熱帶藤本植物。天然香草蘭提取物是全世界價格最昂貴的風味成分之一，其中60%用于食品行業，33%用于化妝品行業，7%用于芳香保健行業[1]。香草蘭是名貴的天然香料且香味獨特，素有“食品香料之王”的美稱[2]，其香味物質主要成分是香蘭素(C8H8O3)。青豆莢僅有青草香，經過加工后形成香草蘭特有的香氣成分，其加工過程經過殺青、發酵、干燥、陳化生香，最終形成組分復雜的香氣，包括烷烴、醇類、醛酮類、酯類、酚類、酸類、少量苯、醚類等[2-4]。據王慶煌等[5]報道，酶促反應在香草蘭發酵生香過程中起最重要的作用，其主要作用酶有β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、果膠酶、纖維素酶。

通過預處理或外源添加酶處理天然香草蘭青豆莢對香蘭素含量的影響報道較少。Roode等[6]和Dignum[7]報道通過破壞細胞壁處理，增加β-葡萄糖苷底物與β-葡萄糖苷酶的接觸顯著提高了香草蘭中香蘭素的含量。Sreedhar[8]采用萘乙酸和乙烯利溶液預處理香草蘭青豆莢，結果表明香蘭素分別提高4倍和3.6倍。姜欣等[9]向香草蘭浸膏中加入β-葡萄糖苷酶，結果發現酶與香蘭素的含量呈正相關關系。Naidu等[10]研究酶法輔助提取香草蘭豆莢中的香蘭素，結果發現添加茶葉酶或者戊聚糖復合酶均可提高香蘭素。Ruiz-Terán等[11]使用戊聚糖復合酶和纖維素酶兩步法明顯提高香草蘭中香蘭素的含量。Gu Fenglin等[12]考察纖維素酶添加量、溫度和加熱時間對提取香草蘭中香蘭素的影響，結果表明在優化條件下香蘭素含量明顯升高。

據Zidi等[13]報道，每年香蘭素的產量達到12000t，然而從天然豆莢中提取的香蘭素不足1%，大多數為化學合成。香草蘭青豆莢中葡糖香蘭素的含量在10%～15%，理論上經酶解能夠轉化為約5%的香蘭素，但是采用傳統的加工方法，僅得到平均約2%的香蘭素[14]。世界香蘭素年需求增長率為10%，國際市場對天然香蘭素的需求更為迫切[10]。因此，對香草蘭發酵生香過程中如何通過外源添加酶提高香蘭素含量的研究顯得尤為迫切。

課題組前期發現發酵生香后的香草蘭豆莢添加纖維素酶可以大大提高香蘭素的提取率，在此基礎上，本實驗擬通過考察外源添加纖維素酶處理香草蘭青豆莢反應條件，優化香蘭素提取工藝，為提高天然香草蘭豆莢中香蘭素含量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香草蘭青豆莢 中國熱帶農業科學院香料飲料研究所；香蘭素標準品 美國Sigma公司；纖維素酶(15000U/g) 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、冰醋酸(均為分析純) 天津天大化工實驗廠。

1.2 儀器與設備

索氏提取器 四川蜀牛玻璃儀器公司；RT5高效多點加熱磁力攪拌器 德國IKA公司；1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；KQ-600B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點參照Ruiz-Terán等[11]的方法并部分修改，具體如下：

工藝流程：香草蘭勻漿→分裝→酶解→滅酶→醇提→過濾→定容→待測樣。

操作要點：挑選一級香草蘭青豆莢，洗凈備用。準確稱取香草蘭青豆莢200.0g，按1:1(g/mL)加入水勻漿(香草蘭勻漿液pH5.4，不需要加入緩沖溶液調節pH值)，平均分成20份，每份20g，在指定溫度條件下加入纖維素酶，酶解固定時間后，于沸水浴中保溫10min滅酶。濾液冷卻后加入無水乙醇，使乙醇的體積分數為47.5%，室溫條件下醇提30min，過濾，定容得到香蘭素浸提液，樣品待上液相檢測計算香蘭素含量。

1.3.2 水分測定

香草蘭青豆莢水分測定采用GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》測定，其水分含量為86.19%。

1.3.3 香蘭素含量測定

根據Brunerie[15]的方法略作修改，色譜柱：ZORBAX XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：甲醇-0.5%冰乙酸溶液(20:80，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫(26℃)；進樣量：3μL；檢測波長：280nm；靈敏度：0.01AUFS。以色譜峰的保留時間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性；以外標法峰面積定量，本實驗中所有香蘭素含量結果均換算為干基含量(%)。

1.3.4 單因素試驗

分別以不同的酶解溫度、酶添加量、酶解時間為單因素進行試驗，考察各單因素對香蘭素含量的影響，每組試驗重復3次。

1.3.5 二次回歸中心組合設計

在課題組前期試驗基礎[12]和單因素試驗基礎上，得出影響香蘭素含量的主要因素為：酶解溫度、酶添加量和酶解時間，采用二次回歸中心組合設計法，對這3個主要影響因子進行最佳提取條件的選擇，各個自變量按照Xi＝(xi-x0)/Δx進行水平編碼換算，其中xi為自變量的真實值；x0為試驗中心點處自變量的真實值；Δx為自變量的變化間距。每組試驗重復3次。各因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

1.4 統計分析

采用Design Expert 7.0.1分析軟件對數據進行分析處理。自變量(反應溫度、纖維素酶添加量、反應時間)和響應值(香蘭素含量)的關系用二級多項式回歸模型表示，模型的充分性用決定系數(R2)和失擬檢驗(lack of fit)表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度的影響

固定酶添加量16.73mg、酶解時間12h，分別考察酶解溫度為30、40、50、60、70℃對香蘭素含量的影響，結果如圖1所示。

圖1 酶解溫度對香蘭素含量的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on vanillin content

由圖1可知，當溫度從30℃升高到50℃時，香蘭素含量從0.76%增加到1.44%，繼續升溫到70℃，則香蘭素含量降為0.69%。這是由于在酶解反應中，溫度會影響酶的穩定性進而影響酶解反應速率。據呂長鑫等[16]報道的結果，這是由于剛開始隨著溫度逐漸升高，酶的活性增加，導致反應速率加快；當達到酶解反應最適溫度，酶的活力最高，最利于酶解反應的進行；隨后，當溫度繼續升高，會鈍化部分酶分子，降低酶活力，從而導致反應速率降低；當溫度過高時酶完全失活。

2.1.2 酶添加量的影響

固定酶解溫度和酶解時間分別為50℃和12h，分別考察酶添加量為0、10、20、30、40、50mg對香蘭素含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 酶添加量對香蘭素含量的影響Fig.2 Effect of enzymatic addition amount on vanillin content

由圖2可知，當酶添加量從0mg增加到20mg時，香蘭素含量呈現顯著增加的趨勢(0.69%增加到1.24%)；當酶添加量達到30mg時，香蘭素含量達到1.59%；之后再增加酶量，香蘭素含量趨于平衡。據石亞中等[17]報道，酶與底物接觸反應過程中，存在平衡點，當酶添加量低于平衡點時，底物與酶可以充分結合；當酶量繼續增加，底物與酶的結合程度會加大，當反應達到平衡后，酶活性趨于穩定。因此，酶添加量越大并不意味著越利于酶解效果，對于底物量一定時，存在一個最佳的酶用量。

2.1.3 酶解時間的影響

固定酶解溫度50℃、酶添加量16.73mg，分別考察酶解時間為0、6、12、18、24、30h對香蘭素含量的影響，結果如圖3所示。

圖3 酶解時間對香蘭素含量的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on vanillin content

由圖3可知，酶解反應隨著反應時間從0h增加到12h，香蘭素含量逐漸由0.34%增大到1.21%，再延長酶解時間，香蘭素含量基本維持在1.61%水平。據董旭等[18]的報道，添加酶后酶與底物結合程度低，酶解效果不明顯，隨著反應時間的延長，底物與酶接觸的機會增大，酶解效果增加；當達到最佳酶解時間，酶已經達到與底物反應的最大活力，如果再延長酶解時間，酶解效果基本維持穩定，這正與本實驗結果相一致。

2.2 二次回歸中心組合模型擬合及方差分析

表2 二次回歸中心組合試驗設計及結果Table 2ble 2 Experimental design and results for response surface analysis

選取酶解溫度(X1)、酶添加量(X2)和酶解時間(X3)為自變量，以香蘭素含量(Y)為響應值進行響應面分析，結果如表2所示。20個試驗點的響應值進行回歸分析，得到回歸方程：

表3 模型各項回歸分析Table3 Results of regression analysis

表4 模型方差分析Table4 Results of analysis of variance

表5 回歸方程系數顯著性檢驗表Table5 Statistical significance of each coefficient in the regression equation

對模型進行方差分析，結果見表3～5。由表3可知，模型顯著(P＜0.0001)。由表4可知，失擬項不顯著(P=0.0527＞0.05)，R2=0.9059表明此模型能解釋90.59%響應變化，回歸方程擬合程度良好，因此此模型可以真實地擬合和預測實際情況，具有很好的代表性。由表5可知，一次項B1、B2、B3顯著，二次項B11顯著，B22和B33不顯著，交互項B12、B13和B23不顯著。因素B1、B2及B3的P值分別為0.0228、＜0.0001及0.0035，表明酶解溫度，酶添加量和酶解時間影響顯著，3個因素對香蘭素含量影響的順序為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。

2.3 回歸模型的響應面分析

采用Design Expert 3D Surface對關于實數變方程做曲面圖以直觀反映局部參數值與整體響應值直接的交互對應關系[19]。

由圖4a可知，香蘭素含量隨著酶添加量的增加呈現增加的趨勢，而隨著反應溫度的升高出現先增加后降低的趨勢。酶解時間在中心點，酶解溫度為50℃，酶添加量從7.93mg增加到25.53mg時，香蘭素含量從1.22%增加到1.70%，之后趨于平衡；酶解時間在中心點，酶添加量為16.73mg，溫度從38.11℃增加到61.89℃時，香蘭素含量先從1.31%增加到1.54%后降低為1.51%，這說明酶添加量并不是越多越好，當酶添加量達到飽和再增加酶用量不僅不會提高香蘭素含量反而增加成本，而溫度升高則會降低酶活力導致香蘭素含量降低。從曲線彎曲程度可知酶添加量對響應值(香蘭素含量)影響更顯著。

圖4 各兩因素交互作用對香蘭素含量的影響Fig.4 Response surface plots showing the interaction effects of various independent variables on vanillin content

由圖4b可知，香蘭素含量隨著酶解溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，而隨著酶解時間的延長呈現增加的趨勢，而后趨于平緩。當酶解時間為12h，溫度從38.11℃增加到61.89℃時，香蘭素含量先從1.31%增加到1.54%后降低為1.51%，結合單因素試驗結果當溫度升高為80℃時，香蘭素含量降低為1.01%；當酶解溫度為50℃，酶解時間從8.43h延長至15.57h，香蘭素含量從1.45%增加到1.73%。此外，由曲線彎曲程度可知酶解時間對香蘭素含量的影響較酶解溫度更為顯著。

由圖4c可知，香蘭素含量隨著酶添加量的增加而呈現增加的趨勢，當酶解時間固定為12h，酶添加量從25.53mg增加到50mg時，香蘭素含量維持在1.60%左右；香蘭素含量隨著酶解時間的延長呈現平穩增長的趨勢后趨于平衡，結合單因素試驗結果，當酶添加量為16.73mg，酶解時間從16h增加到24h時，香蘭素含量為(1.63±0.05)%。由曲面彎曲程度可知酶添加量對香蘭素的含量影響較酶解時間更為顯著。

2.4 最佳工藝條件的確定及驗證

采用Design Expert軟件分析得到本實驗的最佳合成工藝條件為酶解溫度53.03℃、酶添加量26.88mg、酶解時間16.02h，可以得到理論上最優香蘭素的含量2.26%。結合實際的操作條件，得最佳反應條件為酶解溫度53℃、酶添加量26.9mg、酶解時間16h，在此條件下做3次平行驗證實驗，結果如表6所示，最佳條件下香蘭素含量為2.18%，說明該模型用于預測香蘭素含量最高時三因素的組合方案具有可行性。

表6 驗證實驗Table6 Results of validation experiments under the optimized hydrolysis conditions

由于試驗的誤差存在，與預測的最高值有偏差，相對誤差為3.67%，表明由回歸方程所得的預測值與實際情況相差不大，說明回歸方程能夠比較真實地反映各因素對香蘭素含量的影響。同時由表6可知，經過傳統發酵后的香草蘭豆莢經索氏抽提后的香蘭素含量測定為1.97%，而本實驗通過優化后的香蘭素含量為2.18%，高于傳統發酵生香法，在縮短時間的基礎上得到高于傳統發酵生香香草蘭青豆莢中香蘭素含量，大大節約了成本。

3 結論與討論

在課題組前期試驗基礎上，利用香草蘭青豆莢作為原料，嘗試外源添加纖維素酶提高香草蘭主要香味物質——香蘭素，在單因素試驗基礎上，采用可旋轉的二次回歸中心組合試驗設計考察酶解溫度、酶添加量和酶解時間3個變量對香蘭素含量的影響，最終確定最佳工藝條件為香草蘭青豆莢10g、酶解溫度53℃、酶添加量26.9mg(15000U/g)、酶解時間16h。驗證實驗表明在一定誤差范圍內外源添加纖維素酶可以提高香蘭素含量，與傳統發酵后的香草蘭豆莢經索氏提取后的香蘭素含量相比，香蘭素含量提高了0.21%。

本課題組成員Gu Fenglin等[12]前期考察經過傳統發酵生香后的香草蘭豆莢通過添加外源纖維素酶處理，結果得到香蘭素提取率高達7.61mg/g；Ruiz-Terán等[11]使用戊聚糖復合酶和纖維素復合酶兩步法處理香草蘭青豆莢，結果得到香蘭素含量為3.66%；Naidu等[10]研究茶葉酶法輔助提取香草蘭青豆莢中的香蘭素，結果表明其香蘭素含量為4.2%；Waliszewski等[20]采用3種復合酶制劑預處理香草蘭切段豆莢，結果發現香蘭素含量增加2倍達到2.09%。與前人的結果相比，本實驗優化后的香蘭素含量(2.18%)低，結果歸為Gu Fenglin等[12]前期考察的是經過發酵生香后添加纖維素酶，而本實驗采用的原料是香草蘭青豆莢；而Ruiz-Terán等[11]和Waliszewski等[20]采用的是復合酶，據王慶煌等[5]報道香草蘭發酵生香過程中最重要的作用酶有β-葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶，且這些酶相互作用將大大提高香蘭素含量；Naidu等[10]采用的是茶葉復合酶，不同的酶之間性質不同，如酶活力、最適溫度、pH值等。目前本實驗只考察了纖維素酶對香草蘭青豆莢中香蘭素含量的影響，基于前面討論，主要作用酶果膠酶和β-葡萄糖苷酶分別作用和復合作用對香草蘭青豆莢中香蘭素含量的影響如何還有待于進一步探討。

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Quadratic Regression Central Composite Method for the Optimization of Enzymatic Extraction of Vanillin from Vanilla (Vanilla planifolia Andrews) Pods with Exogenous

MO Li-mei1，ZHANG Yan-jun2，GU Feng-lin2,3，XU Fei2，LU Min-quan2,*
(1. College of Food Science, Hainan University, Haikou 570228, China；2. Institute of Spice and Beverage Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning 571533, China；3. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops, Ministry of Agriculture, Wanning 571533, China)

This study was conceived to develop an optimized procedure for enzymatic extraction of vanillin from vanilla green pods with exogenous cellulase. For this, quadratic regression central composite design combined with response surface methodology was employed to investigate the effects of enzymatic hydrolysis temperature, cellulase dosage and enzymatic hydrolysis time on vanillin content. The results showed that the optimum conditions of vanilla green pods, enzymatic hydrolysis temperature, cellulase and enzymatic hydrolysis time were 10 g, 53 ℃, 26.9 mg and 16 h, respectively. The maximum vanillin content under these conditions was 2.18% compared to 1.97% obtained with the conventional method of fermentation and subsequent ethanol reflux extraction.

vanillin；cellulase；condition optimization

Q55

A

1002-6630(2013)18-0018-05

10.7506/spkx1002-6630-201318004

2013-04-10

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD36B03)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(1630052013006)

莫麗梅(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為熱帶農產品加工。E-mail：molimei2007@yeah.net

*通信作者：陸敏泉(1972—)，男，副研究員，碩士，研究方向為熱帶農產品加工。E-mail：lmq663@126.com