小鼠DUSP1 3'-UTR雙熒光素酶報告基因表達系統的建立及功能鑒定

溫曉梨，孫宏衛，歐小利，王妮，梅柱中，姜勇

在細胞的炎癥反應中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的激活處于核心地位。有研究顯示，抑制p38MAPK與JNK激酶的功能可有效減輕炎癥癥狀[1]。雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatases 1，DUSP1)又稱MKP1絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MAPK phosphatase 1)，在細胞內主要催化已活化的MAPK家族成員(p38、JNK、ERK)特異性基序TxY中磷酸基團的水解，從而抑制其活性。MAPK激活可快速誘導DUSP1基因的表達，是MAPK信號轉導通路中重要的負反饋調節機制[2-3]。近年發現，某些基因mRNA的3'端非翻譯區(untranslated region，UTR)存在富含腺嘌呤核苷與尿嘧啶核苷的元件(adenosine and uridine rich element，ARE)，多種ARE結合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)如人抗原R(HuR)、含KH結構域的剪切性調節蛋白(KHSRP)、鋅指蛋白(TTP)等，均可通過與ARE的特異性結合而調控相關基因的表達水平[4-5]。另外，小分子RNA(miRNA)也可通過識別3'-UTR特異性序列而介導靶基因mRNA的降解或(和)翻譯抑制。有研究顯示HuR和microRNA101可與DUSP1 3'-UTR結合，從而在轉錄后水平調控DUSP1基因的表達[6-7]。生物信息學分析發現，在DUSP1 mRNA的3'-UTR中存在3個ARE元件以及多個潛在的miRNA結合位點，為進一步篩選可通過DUSP1 3'-UTR調控DUSP1基因表達的RNA結合蛋白(RBP)和miRNA，本研究構建了DUSP1 3'-UTR雙熒光素酶報告基因表達載體，并對其功能進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 真核表達載體pGL3-control、pRL-TK、pCDNA3.1、pcDNA3.1-HuR-FLAG、大腸埃希菌DH5α、NIH3T3和RAW264.7細胞(美國ATCC)，24孔板和細胞培養皿(Corning 公司，美國)，DMEM培養液和胎牛血清、總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司，美國)，DNA ladder、KOD Plus DNA聚合酶(TOYOBO，日本)，限制性內切酶、T4DNA連接酶(TaKaRa公司，日本)，質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒、Dual-Luciferase? Reporter Assay System檢測試劑盒(Promega公司，美國)，jetPRIME轉染試劑(Polyplus公司，法國)，mmu-miR101a(上海吉瑪公司合成)，其他試劑均為國產分析純。引物合成及測序由Invitrogen公司(美國)完成。

1.2 方法 從GenBank獲得小鼠DUSP1 3'-UTR的編碼序列并進行生物信息學分析，其中miRNA的潛在結合位點采用TargetScan 6.0(http∶//www.targetscan.org)軟件進行分析。

1.2.1 小鼠DUSP1 3'-UTR的RT-PCR擴增 RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2條件下在3.5cm皿中培養，達70%~80%融合時按Trizol試劑說明書提取總RNA。采用RT-PCR擴增DUSP1 3'-UTR目的片段，上游引物為3'-AGGGCAAGGGGAGGTGTGGAG-5'，下游引物為3'-GAGAATTCCAATAGAAACGTCATAATTTATTC TG-5'，下劃線為EcoRⅠ酶切位點，擴增產物大小為693bp。采用KOD Plus 聚合酶進行PCR反應，反應條件為： 94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 1min，35個循環。1.2.2 pGL3-Luc-DUSP1-3'UTR(LuDP)重組質粒的構建 DUSP1 3'-UTR的PCR擴增產物采用EcoRⅠ進行酶切，pGL3-control載體先進行XbaⅠ酶切并用Klenow DNA聚合酶大片段補平，然后采用EcoRⅠ進行酶切，將PCR擴增產物的酶切片段和pGL3-control載體的酶切片段通過瓊脂糖凝膠回收，采用文獻[8]中的方法將DUSP1 3'-UTR片段克隆至pGL3-control載體中熒光素酶(luciferase)編碼序列的下游，獲得LuDP重組質粒，并對LuDP進行PCR擴增、限制性內切酶酶切、DNA測序鑒定。

1.2.3 LuDP/RL重組質粒的構建 將LuDP用NotⅠ和BamHⅠ，pRL-TK用BglⅡ和XbaⅠ，pLenti6-TR用NotⅠ和XbaⅠ分別進行雙酶切，將LuDP中的熒光素酶表達模塊與來源于pRL-TK質粒的海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)表達模塊克隆至處理好的pLenti6-TR質粒中，得到重組質粒LuDP/RL，對重組體進行PCR擴增及限制性內切酶酶切鑒定。

1.2.4 細胞分組及熒光素酶活性檢測 將NIH3T3細胞以4×104/孔鋪于24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2條件下培養，24h后至細胞融合度約為40%時，按jetPRIME轉染試劑說明書操作，0.1μg pRL-TK分別與0.1μg LuDP和pGL3-control(作為陽性對照)共轉染，0.2μg LuDP/RL分別與0.1μg HuR表達載體(pcDNA 3.1-HuR-FLAG)和pCDNA3.1(作為對照)共轉染，0.2μg LuDP/RL分別與50nmol/L mmu-miR101a和Control dsRNA(作為對照)共轉染，48h后收獲細胞，采用Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，具體操作按說明書進行。

圖1 小鼠DUSP1 3'-UTR序列生物信息學分析結果Fig. 1 Bioinformatics analysis of mouse DUSP1 3'-UTR sequence1. Potential binding site of miR-25/32/92abc/363-3p/367; 3. Potential binding site of miR429/200b/200c; 5. Potential binding site of miR-let7/miR98; 6. Potential binding site of miR144/miR101ab; 2, 4, 7. Adenosine and uridine rich elements (AREs)

圖2 LuDP重組質粒的Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定Fig. 2 Identification of plasmid LuDP by Hind Ⅲ/EcoR Ⅰenzyme digestionM. DNA ladder; 1. LuDP digested by HindⅢ/EcoRⅠ

圖3 LuDP/RL質粒模式圖Fig.3 Schematic diagram of LuDP/RL

2 結 果

2.1 小鼠DUSP1 3'-UTR生物信息學分析結果 從GenBank獲得小鼠DUSP1 3'-UTR全長序列并進行生物信息學分析，結果顯示其中含有3個ARE元件和4個潛在的miRNA結合位點(圖1)。

2.2 LuDP與LuDP/RL重組質粒鑒定結果 LuDP質粒全長5954bp，經HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后可得到約2.2kb和3.7kb的片段，大小符合預期(圖2)。LuDP/RL質粒大小為10 706bp，經XbaⅠ單酶切后可得到約6.8kb、2860bp和320bp的片段，大小符合預期，經HindⅢ單酶切后可得到3660、3354、2365、560、470、312bp的片段，大小符合預期。LuDP/RL質粒模式圖如圖3所示，測序結果進一步證實重組質粒構建成功。

2.3 熒光素酶報告基因活性檢測結果 將質粒LuDP與內參照質粒pRL-TK共轉染NIH3T3細胞，48h后回收細胞進行檢測，結果顯示其熒光素酶活性是陽性對照(pGL3-control與pRL-TK共轉染NIH3T3細胞)的0.14±0.01倍，差異有統計學意義(P＜0.01)，表明DUSP1 3'-UTR對基因的表達起負調控作用。將LuDP/RL分別與RNA結合蛋白HuR表達載體、mmu-miR-101a共轉染NIH3T3細胞，48h后回收細胞進行檢測，結果顯示共轉染HuR表達載體后，其熒光素酶活性是對照組的1.40±0.20倍，而共轉染mmu-miR-101a后，熒光素酶活性是對照組的0.57±0.18倍，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

3 討 論

基因在細胞中的轉錄后調控通常是由位于成熟mRNA的5'或3'端非翻譯區(UTR)的特異性調控元件與特定的RNA結合蛋白和(或)非編碼RNA相互作用，介導成熟mRNA的出核轉運、胞質定位、蛋白翻譯，從而調控基因在細胞中的表達[9]。在參與基因轉錄后調控的多種順式調控元件中，定位于mRNA 3'-UTR的ARE在基因表達調控中的作用研究得最多，多種ARE結合蛋白可通過與ARE元件的特異性結合而正向(如HuR蛋白)和(或)負向(如TTP蛋白)調控靶基因在細胞中的表達水平。此外，miRNA通過與3'-UTR結合而促進靶mRNA的降解和(或)翻譯抑制也是近年來基因轉錄后調控的研究熱點[7,10]。

前期研究表明，DUSP1是細胞炎癥反應中的關鍵性負調控因子[11]。Hammer等[12]采用LPS刺激來源于DUSP1基因敲除(DUSP1-/-)小鼠的骨髓巨噬細胞，結果顯示炎癥相關的細胞因子如IL-6、IL-10、TNF、IL-1β和炎癥趨化因子等的表達明顯上調。但目前DUSP1基因調控細胞炎癥反應的研究主要集中在轉錄水平，因此進一步探討細胞炎癥反應中DUSP1的轉錄后調控機制具有重要的理論與實踐意義。近年來已有報道指出RNA結合蛋白通過與3'-UTR的特異性結合而調控DUSP1基因表達，如Lin等[13]在誘導3T3-L1前脂肪細胞分化的過程中發現RNA結合蛋白TTP可促進DUSP1 mRNA的降解，而Kuwano等[6]報道RNA結合蛋白HuR在細胞受到H2O2刺激時可上調DUSP1 mRNA的表達。此外，多種RNA結合蛋白如NF90、TIA-1、TIAR等均被發現可與DUSP1 mRNA的3'-UTR相互結合[6]，但它們對DUSP1基因表達的調控作用尚有待進一步驗證。本研究通過生物信息學分析發現，DUSP1 3'-UTR含有3個ARE序列和4個潛在的miRNA結合位點，提示轉錄后水平的調控可能在DUSP1基因表達中具有重要地位。而本研究的初步結果也表明，將DUSP1 3'-UTR克隆至熒光素酶基因的下游可下調其在NIH3T3細胞中的表達，表明DUSP1 3'-UTR中含有負調控基因表達的順式作用元件。

為了便于采用siRNA文庫進一步篩選通過3'-UTR調控DUSP1基因表達的RNA結合蛋白及miRNA分子，本研究構建了含有DUSP1 mRNA的3'-UTR全長序列的雙熒光素酶報告基因表達質粒，該質粒同時含有熒光素酶與海腎熒光素酶(RL)兩個各自獨立的表達模塊，將其轉染細胞后，可將海腎熒光素酶作為轉染的內參照，從而降低不同樣品核酸轉染效率差異對實驗結果的影響，同時由于海腎熒光素酶與熒光素酶基因位于同一個載體，其比例固定，便于不同批次實驗結果的比較與統計。此外，本研究用熒光素酶及海腎熒光素酶的表達模塊替換了慢病毒表達載體pLenti-TR中的TR表達模塊，而保留了與慢病毒包裝相關的所有元件，因此所構建的LuDP/RL載體可以通過慢病毒包裝，所獲得的假病毒可感染巨噬細胞等傳統方法難以轉染的細胞，有助于研究炎癥刺激對DUSP1基因轉錄后水平調控的機制。本實驗在NIH3T3細胞中分別共轉染LuDP/RL與HuR表達載體和mmu-miR101a，結果與文獻報道一致[6-7]，表明已成功構建了含有小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR的雙熒光素酶報告基因表達載體，該載體不僅可用于驗證DUSP1 3'-UTR中調控元件對DUSP1的影響，還可作為篩選與DUSP1 3'-UTR結合并對DUSP1有調控作用的RBPs和miRNAs的平臺，為進一步研究DUSP1基因的轉錄后調控機制奠定了基礎。

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