艾炷灸對兔動脈粥樣硬化斑塊穩定性物質基質金屬蛋白酶-2、9mRNA的影響

章海鳳,常小榮*,劉 密,岳增輝,謝 輝,劉未艾

(1.湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410007；2.郴州市第一人民醫院，湖南 郴州 423000)

基質金屬蛋白酶是鋅離子依賴的一組蛋白水解酶(matrix metalloproteinases，MMP)，MMP主要功能為降解多糖以外的全部細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分，ECM成分主要有膠原蛋白、非膠原蛋白、蛋白聚糖以及彈力蛋白等,在靜態下ECM對動脈粥樣硬化斑塊起到支持、連接和保護的作用,而炎性細胞浸潤及炎性介質的釋放能打破ECM的動態平衡。動脈粥樣硬化的主要病理特征是血管壁慢性炎癥改變，受到致病源侵襲的血管內皮細胞表達黏附分子，吸引大量的炎癥細胞進入內皮層，其分別釋放的各種細胞因子在斑塊形成、進展和破裂中發揮著關鍵的作用。因此,ECM合成減少和降解增加，是斑塊破裂引發缺血事件的主要內在原因，而基質金屬蛋白酶對ECM的降解成為動脈粥樣斑塊不穩定的重要因素[1]。針灸用于改善動脈粥樣硬化具有獨特的優勢并取得了良好的臨床療效[2]，針灸還具有簡單易行、經濟有效的特點，因此課題組進一步提出：艾炷灸是否可以通過調節基質金屬蛋白酶-2、9表達的變化，從而達到穩定粥樣斑塊的作用。這將為臨床合理應用針灸治療干預本病的發生發展，提供重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康新西蘭大耳白兔60只，雌雄各半，體質量1.8～2.2 kg，3月齡，由湖南東創實驗動物中心提供(合格證號：醫動檢證字2006-0001)，普通飼料由湖南東創實驗動物中心提供。每只分籠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心,飼養溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。將60只兔隨機分為4組，每組15只，即：空白組(空白對照組)；模型組(AS模型組)；艾炷灸組(AS模型加艾炷灸)；西藥組(AS模型加阿托伐他汀)。

1.2 主要試劑 艾炷：選用蘇州東方艾絨廠生產的“神灸300灸”艾炷(型號:東方1型，艾炷下有3 mm厚的紙制底盤，可直接黏于穴位上)，阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業股份有限公司產品，國藥準字號：H19990258，批號：090203440)；牛血清白蛋白、膽固醇(sigma)；卵清白蛋白、血脂試劑(羅氏)；膽酸鈉(上海藍季科技發展有限公司)；2.5%戊二醛,2%鋨酸，50%、70%、90%、100%各濃度丙酮,Epon812環氧樹脂包埋液(中南大學湘雅醫學院超微結構檢測中心配制)；原位雜交試劑盒(天津灝洋生物公司)。

1.3 造模方法 除空白組外,其余3組均喂飼高脂飼料(在普通飼料中加15%蛋黃粉、5%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉，由湖南中醫藥大學實驗動物中心加工成顆粒飼料),并于第1、3、5天各從耳緣靜脈注射牛血清白蛋白125 mg/kg體質量，共3次；同時用卵清白蛋白進行皮下注射，2.5 mg(kg·/次)，2天1次，共5次，空白組只喂普通飼料，每只兔進食量按30 g/(kg·d)給予，并根據體質量增減不斷調整進食量。各兔均自由飲水,共飼喂16周，每周稱體質量1次并記錄。

1.4 實驗方法 艾炷灸組每天喂飼高脂飼料同時并進行艾炷直接灸，第Ⅰ組選穴為巨闕及雙側天樞、豐隆共5穴，第Ⅱ組選穴為雙側心俞、肝俞及脾俞共6穴。取穴定位參照《實驗針灸學》[3]及擬人比照法制定。取穴定位后剪毛，將直徑0.5 cm的艾炷直接黏于穴位上，點燃施灸，待艾炷燃完余熱散盡后再換另1壯。每穴連續灸3壯(約15～20 min),每日1次，Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，連續治療16周；西藥組每天喂飼高脂飼料，并在高脂飼料中加入阿托伐他汀1 mg/(kg·d)；空白組每天喂飼普通飼料，不進行任何干預；模型組每天喂飼高脂飼料，不進行任何干預。

1.5 觀察指標及檢測方法 兔動脈粥樣硬化斑塊中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達檢測，兔處死后,快速將主動脈從根部分離至腹主動脈分叉處斷離，取主動脈弓下1.5～3.5 cm、長約2 cm的一段組織，縱向剪開攤平，放入4%多聚甲醛液內固定，4 ℃保存。將固定后的組織材料進行洗滌與脫水；進行適當的透明處理；然后浸蠟與包埋；包埋好的蠟塊用刀片修成規整的方形或長方形,進行貼片與烤片后待檢。采用原位雜交法檢測兔動脈粥樣硬化斑塊中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達。取斑塊全部為目標位置，每張玻片隨機取400倍照片5個視野。用IMAGE-PLUS-5.0軟件進行灰度掃描，測定吸光度IA值，取其平均值進行半定量分析(顏色標準H 7-50，S 0-255，I 0-128)。

2 結果

艾炷灸對兔動脈粥樣硬化斑塊中基質金屬蛋白酶-2、9 mRNA表達的影響，見表1。

表1 艾炷灸對兔動脈粥樣硬化斑塊中MMP-2、9 mRNA表達的影響(±s) IA值

由表1可以看出：與空白組相比，模型組AS斑塊中MMP-2、9 mRNA表達差異具有統計學意義(P<0.01)，表明通過高脂飲食和免疫損傷成功建立了兔AS模型。與模型組相比,艾炷灸組和西藥組AS斑塊中MMP-9 mRNA表達差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，表明艾炷灸和西藥組能抑制兔AS斑塊中MMP-9的表達；與模型組相比，西藥組AS斑塊中MMP-2 mRNA表達差異具有統計學意義(P<0.01)，而艾炷灸組AS斑塊中MMP-2 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；與西藥組相比AS斑塊中MMP-2、9 mRNA表達差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，表明艾炷灸抑制兔AS斑塊中MMPs表達的作用不如西藥組。

3 討論

AS的發病率隨著人們生活水平的提高不斷上升，而由此導致了大量的心腦血管疾病的發生，其中約70%～75%心腦血管疾病與AS易損斑塊破裂的形成密切相關，MMPs是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，MMPs可由AS斑塊內的內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及平滑肌細胞等產生[4]，而基質金屬蛋白酶中MMP-2,9對斑塊的不穩定性關系非常密切[5]。易損斑塊由于其薄纖維帽、脂質含量多，容易破裂并形成血栓，而AS血栓形成是導致心血管病癥發病和死亡的首要原因[6]。因此穩定斑塊破裂成為防治急性心血管事件的重要目標。

MMPs已成為心血管病治療的一個靶點[7],通過減少MMPs的表達是心腦血疾病治療的新方向。在臨床應用較多的是他汀類藥，但他汀類藥物可能會引起肝毒性和肌肉炎癥，而AS是慢性疾病，需要長期用藥，病人依從性較差，不利于病人病情的穩定。目前人工合成的MMPs抑制劑如Marimastat(BB2516)[8]、GM6001[9]，具有抑制MMPs的作用，但藥物毒副作用較大，且特異性不強，并不能達到預期的效果。

針刺通過抑制內源性MMP-9合成和分泌,在某種程度上可降低MMP-9相關信號傳導途徑，減輕MMP-9導致的基質降解，使得相關病理過程如腦水腫、白細胞浸潤、血腫擴大等得以緩解，達到拮抗腦損傷的作用[10]。針刺可降低MMP-2表達，減少腦水腫程度，起到保護腦組織的作用[11]。針灸在改善AS上能起到比較好的療效，本課題組在前期研究[12-14]中發現隔藥餅灸對高脂血癥合并AS有肯定療效，具有降脂及抗動脈血管內皮損傷的作用，并且隔藥餅灸還具有穩定粥樣斑塊的作用。因此，本次試驗推測艾炷灸能否通過調節MMP-2,9的表達，達到穩定粥樣斑塊、保護腦組織的作用，以豐富針灸治療AS的治療方法。

本次研究所選用的阿托伐他汀是目前臨床常用于治療AS的藥物，符合公認、有效、可比的研究。研究結果表明，通過高脂飲食和免疫損傷已成功建立了兔AS模型，模型組MMP-2,9的表達明顯增高，說明了由炎性細胞產生的MMPs促進了動脈粥樣硬化的形成，這與Hangyuan Guo等[15]的實驗結論一致；與模型組相比，艾炷灸能達到抑制兔AS斑塊中MMP-9的表達作用，相對阿托伐他汀藥物，艾炷灸抑制兔AS斑塊中MMPs表達的作用不明顯。說明艾炷灸對調節MMP-9的表達有一定的作用，艾炷灸可用于穩定粥樣斑塊，艾炷灸雖然沒有達到阿托伐他汀藥物的治療效果，但相對而言，艾炷灸具有毒副作用小、安全、簡便的優勢，可用于豐富AS的治療手段。

本次實驗中，艾炷灸對兔AS斑塊中MMP-2的表達無明顯調節作用。我們推測：針灸對AS的治療效果是肯定的，那么是否是艾炷灸灸炷大小、灸時沒有達到有效治療閾值，或者通過其他的信號途徑對AS起治療作用。在今后的研究中可以進一步探討灸炷大小、灸時對MMP表達的影響；艾炷灸通過其他調節機制達到治療AS的目的。

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