蛋白免疫印跡雜交法研究葛根素對成骨細胞TGF-β1及Smad 2/3蛋白表達的影響

錢康琦，孫玉明*，詹秀琴

(1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210029;2.南京中醫藥大學基礎醫學院,江蘇 南京210046)

骨骼系統的發育異常導致許多疾病，如骨質疏松、骨關節炎、風濕性關節炎等。骨質疏松癥是以骨量減少，骨組織的顯微結構發生改變，并伴隨骨質脆性增加和骨折危險性升高的一類全身性骨骼疾病。以往的研究[1-2]證實了葛根素具有改善骨質疏松的作用，促進成骨細胞分化。近年來,隨著分子生物學技術發展，Smads蛋白家族中的Smad 2/3信號蛋白受到越來越多的關注，而且此類研究尚不多見，因此，從這條信號轉導途徑研究骨質疏松癥的發病機理是一個新的切入點。本實驗擬采用成骨細胞體外培養的方法，探討葛根素對成骨細胞TGF-β1及其信號轉導蛋白Smad 2/3蛋白表達的影響。在分子生物學層面，通過蛋白免疫印跡雜交(Western Bloting)法進一步研究觀察TGF-β1/Smad信號通路在葛根素防治骨質疏松癥的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級，新生24 h小鼠, 均由浙江省動物實驗中心提供。動物合格證：SCXK(浙)2008-0033。

1.1.2 藥物 葛根素:購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200912，20 mg/支，純度為96.0%，性狀為白色粉末，干燥密閉保存。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清(GIBCO，USA)，DMEM培養基(Hyclone)，含EDTA的0.25%胰蛋白酶(WISENT BIOCENTER)，磷酸鹽緩沖液(PBS)及Ⅱ型膠原酶(Gibco)，四唑鹽MTT(Amresco)，二甲基亞砜DMSO(Sigma)，內參一抗(rabbit β-Actin)(Immunoway)，內參二抗(IgG-HRP)(Jackson)，全蛋白抽提試劑盒，5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，10×電轉移緩沖液，WB抗體清除緩沖液，WB封閉液，顯色液，定影液。

1.1.4 主要儀器 高速冷凍離心機(Sigma)，CO2培養箱(Sanyo，USA)，超凈工作臺(蘇州凈化設備廠產品)，三洋超低溫冰箱(Japan)，三用電熱恒溫箱(江蘇淮陰醫療器械廠)，隔熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)，電熱鼓風干燥箱(南京實驗儀器廠)，倒置相差顯微鏡(Nikon)，Western電泳儀(Bio-Rad，USA)，PVDF膜(PALL), X光膠片(上海申貝感光材料廠)，多用脫色搖床(江蘇金壇市正基儀器廠)，振蕩器(上海滬西分析儀器廠)，微量加樣器(Eppendorf)，低溫冰箱(Japan)，全自動酶標光度計(Bio-Rad,USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與傳代 采用酶消化法選取新生小鼠(24 h)顱蓋骨分離得到成骨細胞。先將胎鼠20只75%乙醇中浸泡10 min；無菌切下顱蓋骨置于D-Hanks液內;清除骨膜、血管等結締組織,用D-Hanks液洗凈顱蓋骨5～6次，剪成小骨片(1 mm3)，先后于0.25%胰蛋白酶溶液及0.1%Ⅱ型膠原酶溶液中，在恒溫37 ℃振蕩消化，并重復1次。將含細胞的消化液在1 000 r/min下離心10 min，吸去上清液，沉淀的細胞團塊用培養液洗2次,制成細胞懸液，接種于培養瓶，每瓶接種細胞約2×104/mL，5%CO2，37 ℃培養箱中培養，24 h換液1次，直至80%細胞融合(約2～3 d)，常規消化細胞進行傳代培養。

1.2.2 葛根素干預液的制備 將葛根素對照品先于DMSO中充分溶解后,于無菌過濾器過濾除菌,使用前加入無血清的DMEM培養液并進一步稀釋成為0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL 3種實驗所需濃度的干預液，用不含葛根素的無血清培養液做為對照組，4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 MTT法檢測葛根素對成骨細胞增殖促進率 取第3代成骨細胞用于實驗,用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液。細胞計數后,將成骨細胞濃度調整為1×104個/mL濃度接種于一次性96孔培養板中,每孔180 μL，培養24 h后加入不同濃度的葛根素溶液，分別為0.01、0.1、1 μg/mL及空白對照組，每組設6個復孔，每孔加藥20 μL，空白對照組不加葛根素，加入相同體積的無血清DMEM培養基。加藥分別培養24、48、72 h后，避光條件下，每孔加入20 μL MTT(濃度5 mg/mL)，孵育4～6 h后，小心吸棄孔內上清培養液,每孔加入150 μL DMSO，振蕩10min使結晶物充分溶解。在酶標儀(波長490 nm)上測定各孔吸光度值(OD)，以空白對照組為基準計算成骨細胞不同時間的相對增殖率，實驗重復3次。

1.2.4 Western Bloting法檢測相關蛋白表達 各組成骨細胞用葛根素干預液及空白對照組，處理24 h后，提取各組細胞總蛋白，并用BCA法進行蛋白定量。-20 ℃保存。取各組成骨細胞樣本70 μg，進行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將分離后的蛋白質電轉移到PVDF膜上，4 ℃封閉，過夜后按約0.1 mL/cm2的量加入封閉液和適量一抗抗體TGF-β1、Smad2、Smad3(1∶500)搖床搖蕩孵育(4 ℃，過夜)。TBST漂洗濾膜4次,每次10 min。將膜與HRP結合的二抗(二抗用封閉液稀釋1∶5 000)室溫下搖蕩孵育2 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。將顯影液加于PVDF膜上,室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光,洗片機中顯影、洗像。調整曝光時間，直至出現最佳條帶。

2 實驗結果

2.1 MTT檢測結果 見表1。

2.2 Western Bloting結果 見圖1、圖2、圖3。

表1 葛根素對成骨細胞增殖的促進(±s)

圖1 各實驗組TGF-β1蛋白表達含量的變化

圖2 各實驗組Smad2蛋白表達含量的變化

圖3 各實驗組Smad3蛋白表達含量的變化

3 討論

成骨細胞在分化、增殖過程中受到各種分子機制的信號通路的調節[3]。本實驗研究則是基于TGF-β1這一信號傳導通路的活化作用，其中涉及其相關蛋白Smad2和Smad3的表達。本實驗通過體外培養成骨細胞,并且取其第3代采用噻唑藍還原法(MTT)測定葛根素對成骨細胞生長促進率。數據表明，不同濃度及不同時間作用下，葛根素對于成骨細胞增殖均有促進作用，其中，在24 h各干預組的活化作用最為明顯，并且各組對于成骨細胞促增殖呈現出濃度依賴性。

在促成骨細胞分化中存在著TGF-β1/Smads信號轉導通路，在復雜的骨代謝調控網絡中，已有研究[4-5]證實該信號通路在骨重建中發揮重要作用?；钚缘腡GF-β1既具有刺激骨形成，又具有抑制骨吸收的雙重作用,是骨代謝重要的偶聯調節因子[6]。體內研究[7]表明：在成骨細胞的細胞膜上有TGF-β1的特異性受體，作用于成骨細胞，調節其增殖和分化，同時它們之間相互作用，從而調節骨形成。在TGF-β1促成骨細胞分化過程中，其下游信號轉導分子Smad2、Smad3呈現出由細胞質向細胞核的轉位，介導TGF-β1信號。有實驗[8]表明Smad3基因剔除引起成骨細胞數目減少，破骨細胞數目增多,導致小鼠骨小梁稀疏、骨密度降低,發生骨質疏松。Smad 2/3是TGF-β1信號轉導通路中特異的、起瓶頸作用的重要因子，在骨的形成、重塑和維持過程中發揮著重要作用[9]。通過Smad 2/3的呈遞作用給TGF-β1受體復合物，穩定了先前形成DNA-蛋白復合體及其功能，然后通過與含重要轉錄激活因子或阻礙因子的高分子復合物結合來調節轉錄[10]。當TGF-β1/Smad信號級鏈活化后，Smad2、Smad3可能通過不同的Smads信號復合物的形成來選擇性調節TGF-β1 依賴的特異基因的表達[11]。

蛋白免疫印跡雜交(Western Bloting)技術是利用抗原及抗體之間的特異性相互識別和結合，實現目的蛋白的檢測和初步定量。Western Bloting實驗結果表明，TGF-β1及Smad2/3的蛋白表達情況相對于內參β-action有明顯差異，各實驗組總灰度值比值相比于空白DMEM組隨著干預液的濃度不斷升高呈現出上升趨勢(P<0.05)。Smad 2/3的表達幾乎與TGF-β1的表達平行，呈現出濃度依賴性。各給藥組在蛋白表達方面，不同程度上調TGF-β1與Smad 2/3陽性表達水平，有一定的量效關系，高、中劑量組明顯優于低劑量組。

另外,本研究從TGF-β1/Smad信號通路提示了葛根素對骨質疏松癥的治療作用。葛根素對骨量保持具有正向意義，能夠增強成骨細胞分化的敏感性；葛根素亦可通過調控此信號通路影響成骨細胞的增殖和分化，達到防治骨質疏松的目的。在分子生物學層面，葛根素調節和影響細胞內源性基因TGF-β1/Smad信號表達揭示了成骨細胞增殖分化的相關分子機制,又為其促進骨質疏松的治療提供了新的依據。

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