凡納對蝦溶菌酶基因的克隆與性質研究

杜志強，王建英

（內蒙古科技大學數理與生物工程學院，內蒙古包頭 014010）

凡納對蝦是重要的甲殼類動物，也是目前研究無脊椎動物先天免疫系統的重要模式生物。在無脊椎動物先天免疫系統中，直接發揮抗菌作用的蛋白質分子被稱為免疫效應分子；其中，就包括溶菌酶。溶菌酶是一種能夠直接破壞細菌細胞壁組分之間的β-1，4-糖苷鍵的物質，可以使細菌細胞壁發生水解、內容物外泄而死亡[1]。所以，研究清楚溶菌酶基因的免疫機制，有助于更好的開展對蝦類細菌、病毒疾病的防治工作。本文以凡納對蝦的溶菌酶基因作為研究對象，克隆該基因的cDNA 序列，并且對基因序列的同源性、分子進化上的親緣關系、分子的初級結構等進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

凡納對蝦于包頭市友誼水產市場購買冷凍保存的凍蝦。在實驗室待蝦體完全溶解之后，采集肝胰腺、鰓等組織，用于提取總RNA。

1.1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、PCR 產物DNA 回收試劑盒、總RNA 提取試劑盒（TRizol Total RNA Reagent 試劑盒）、cDNA 第一鏈合成試劑盒、T-載體PCR 產物克隆試劑盒、DEPC、氨芐青霉素鈉、DL2000 DNA Marker：購自上海生工生物工程有限公司；其他有機試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取

參照使用說明書，利用TRizol 總RNA 提取試劑盒提取凡納對蝦的肝胰腺和鰓等組織的總RNA[2]。檢測RNA 的質量后，于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 cDNA 的合成

按照cDNA 第一鏈合成試劑盒的操作說明[3]，將總RNA 逆轉錄為cDNA，作為進行目的基因擴增的模板，反轉錄過程使用的前引物為5′ PCR prime（5′-tacggctgcgagaagacgacagaa-3′），后引物為3′anchor R（5′-gaccacgcgtatcgatgtcgact16（a/c/g）-3′）。

1.2.3 引物設計

根據Genbank 中公布的凡納對蝦溶菌酶基因（Lva-lys）的部分cDNA 序列，設計目的基因特異的克隆引物F（5′-atgagggtgcttcctctggc-3′）和R（5′-aattc gattgttgtaaaaatgg-3′），用來擴增目的基因片段cDNA 的完整開放閱讀框（ORF）序列。

1.2.4 目的片段的PCR 擴增

利用前引物F 和反轉錄使用的后引物3′anchor R引物配對，來擴增目的基因的ORF 的3′端序列；同時利用后引物R 和反轉錄使用的前引物5′PCR primer引物來擴增目的基因ORF 的5`端序列，以凡納對蝦中提取的各種RNA 反轉錄成的cDNA 為模板進行PCR 擴增，PCR 條件為[4]：95 ℃3 min、94 ℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃30 s、35 個循環；72 ℃后延伸5 min。

1.2.5 重組載體的構建與序列測定

使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段的PCR 擴增結果，利用PCR 產物DNA 回收試劑盒（普通離心柱型）進行回收、純化；之后，參照T-載體PCR 產物克隆試劑盒的使用說明書，將基因片段克隆到T-載體中，通過熱激法將重組子轉化到DH5α 宿主菌感受態細胞中[5]；經過藍白斑篩選之后，將陽性克隆子送往上海生工生物工程有限公司測序部，進行基因片段的序列測定。

1.3 生物信息學分析方法

1.3.1 氨基酸序列比對

將克隆得到的凡納對蝦溶菌酶基因（Lva-lys）cDNA 的ORF 序列輸入NCBI 網絡數據庫，進行相關基因序列比對（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）。用Expasy在線軟件對這一基因的cDNA 的ORF 序列進行翻譯，并對翻譯的蛋白質序列進行結構和性質的預測（http：//au.expasy.org）。蛋白質序列信號肽和結構域的預測在SMART（Simple Modular Architecture Research Toll）網站上進（http：//smart.embl-heidelberg.de/）[6]。氨基酸序列比對利用分子生物學軟件DNAMAN 完成。

1.3.2 系統進化樹的繪制

根據NCBI 網絡數據庫中進行的凡納對蝦溶菌酶基因（Lva-lys）相關基因序列比對的結果，選擇物種相近的一些生物的溶菌酶基因，進行氨基酸序列分析之后，利用分子生物學軟件MEGA 4.0 進行系統進化樹的繪制。

1.3.3 分子結構的預測

根據Expasy 在線軟件對凡納對蝦溶菌酶基因的cDNA 序列進行翻譯的結果，利用蛋白質分子初級結構域預測工具SMART 網站進行分子結構的初步預測。

2 結果與分析

2.1 基因克隆和序列分析結果

凡納對蝦溶菌酶基因的cDNA 序列以及演繹的氨基酸序列，見圖1。

圖1 凡納對蝦溶菌酶基因的cDNA 序列以及演繹的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and encoding amino acids sequence of Lva-lys gene

根據序列測定結果，進行序列拼接，得到了凡納對蝦溶菌酶基因cDNA 序列完整的開放閱讀框（ORF）。結果顯示：Lva-lys 基因的ORF 包括477 bp；演繹出158 個氨基酸。在氨基酸一級結構中，N 末端的18 個氨基酸殘基形成信號肽序列（用下劃線標注），第19 個至第148 個氨基酸殘基形成了一個LYZ1 結構域（用方框標注）。在這個溶菌酶的標志性結構域中，包括8 個保守存在的半胱氨酸殘基（用黑色三角形標注），以及組成溶菌酶活性中心的2 個氨基酸殘基——Glu51和Asp68（用黑色五角星標注）。這個重要的LYZ1結構域以及結構域里面的8 個保守存在的半胱氨酸殘基和2 個重要的活性位點，都是溶菌酶發揮抗菌作用的特殊結構。

2.2 氨基酸序列的同源性分析

凡納對蝦溶菌酶基因與其他物種的溶菌酶基因的氨基酸序列比對結果，見圖2。

將克隆得到的凡納對蝦溶菌酶基因（Lva-lys）的cDNA 序列，在NCBI 網上進行基因序列BLAST 比對。從比對結果中，我們選擇了核苷酸序列同源性較高的6 種相近物種的溶菌酶基因，進行氨基酸序列的同源性比對分析。我們發現：凡納對蝦的溶菌酶分子（Lva-Lys）與中國明對蝦溶菌酶（Fch-Lys）、印度明對蝦溶菌酶（Fin-Lys）、南美藍對蝦溶菌酶（Lst-Lys）、日本囊對蝦溶菌酶（Mja-Lys）、羅氏沼蝦溶菌酶（Mro-Lys）、斑節對蝦溶菌酶（Pmo-Lys）在氨基酸序列上具有較高的同源性，相似性達到了92.41%。而且，在這六種溶菌酶分子中，都保守地存在著8 個半胱氨酸殘基和兩個活性位點Glu51和Asp68。

2.3 系統進化樹分析Lva-Lys 與其他溶菌酶分子的親緣關系

在NCBI 網上進行基因序列BLAST 比對之后，我們選擇與凡納對蝦溶菌酶基因的序列同源性較高、而且物種相近的10 種溶菌酶分子，利用分子生物學軟件MEGA 4.0 進行系統進化樹的繪制，結果如圖3。

圖3 Lva-Lys 分子與其他溶菌酶分子的進化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis between Lva-Lys and other lysozyme molecules

在系統進化樹上，凡納對蝦的溶菌酶分子（Lva-Lys）與中國明對蝦溶菌酶（Fch-Lys）、印度明對蝦溶菌酶（Fin-Lys）、羅氏沼蝦溶菌酶（Mro-Lys）、斑節對蝦溶菌酶（Pmo-Lys）、南美藍對蝦溶菌酶（Lst-Lys）、日本囊對蝦溶菌酶（Mja-Lys）分子聚在了一個分支上，而且凡納對蝦的溶菌酶分子（Lva-Lys）與南美藍對蝦溶菌酶分子（Lst-Lys）的親緣關系最近。

2.4 Lva-lys 分子的結構預測

利用蛋白質分子結構域預測工具SMART 網站，進行凡納對蝦溶菌酶分子的分子結構初步預測，Lva-Lys 分子結構的預測結果，見圖4。

圖4 Lva-Lys 分子結構的預測結果Fig.4 The prediction result of Lva-Lys molecule structure

分子結構如圖4 所示，凡納對蝦溶菌酶分子具有一個經典的溶菌酶分子結構域；根據氨基酸一級結構的特點，我們發現在這個溶菌酶分子的LYZ1 結構域中，在固定的位置保守地存在著8 個半胱氨酸殘基，它們可以形成4 對二硫鍵來穩定這個特殊的結構域。另外，在LYZ1 結構域中，存在著溶菌酶活性中心的2 個活性位點——Glu51和Asp68；正是這2 個活性位點發揮了水解細菌細胞壁β-1，4-糖苷鍵的功能[7]，而且在不同物種的溶菌酶分子中，它們十分保守。

3 結論與討論

通過cDNA 序列的克隆，我們獲得了凡納對蝦溶菌酶基因完整的開放閱讀框，經過核苷酸序列以及氨基酸序列比對，發現溶菌酶分子在不同物種中序列同源性較高；而且，關鍵的8 個半胱氨酸殘基以及2 個活性位點，十分保守地存在著，這也是溶菌酶分子能夠廣泛地在不同物種中發揮抗菌作用的結構基礎。通過對分子結構的研究與分析，我們推測：溶菌酶基因在凡納對蝦的先天免疫系統中應該發揮著重要的抗菌功能。而且，目前所做的這些理論研究工作，將為下一步基因功能的研究提供了重要的理論基礎，有助于促進無脊椎動物先天免疫系統的不斷完善。

[1]Mai W J,Wang W N.Protection of blue shrimp (Litopenaeus stylirostris) against the White Spot Syndrome Virus (WSSV)when injected with shrimp lysozyme[J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(4)：727-733

[2]Du Z Q,Ren Q,Zhao X F,et al.A double WAP domain (DWD)-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp,Fenneropenaeus chinensis[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2009,154(2)：203-210

[3]Du Z Q,Li X C,Wang Z H,et al.A single WAP domain (SWD)-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish,Procambarus clarkii[J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(1)：134-142

[4]Sun C,Du X J,Xu W T,et al.Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp,Fenneropenaeus chinensis[J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(4)：517-524

[5]Jia Y P,Sun Y D,Wang Z H,et al.A single whey acidic protein domain (SWD)-containing peptide from fleshy prawn with antimicrobial and proteinase inhibitory activities[J].Aquaculture,2008,284：246-259

[6]Chen D,He N,Xu X,et al.A double WAP domain-containing protein with antiviral relevance in Marsupenaeus japonicus[J].Fish Shellfish Immunol,2008,25：775-781

[7]Pan C Y,Peng K C,Lin C H,et al.Transgenic expression of tilapia hepcidin 1-5 and shrimp chelonianin in zebrafish and their resistance to bacterial pathogens[J].Fish Shellfish Immunol,2011,31(2)：275-85