羅非魚肉水解蛋白Alcalase酶解工藝優化

方細娟，曾慶祝，許慶陵，戰宇，劉鵬，林金鷹，顧采琴

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州 510006）

羅非魚是一種中小型魚，繁殖能力強，生長速度快，肉味鮮美，含有多種不飽和脂肪酸和豐富的蛋白質，素有“白肉三文魚”之稱[1]。2010 年，我國羅非魚（tilapia）產量達120 萬t，占世界總產量的50%以上。羅非魚主要用于加工冷凍魚片出口歐美市場。由于羅非魚體形較扁，制造魚片的利用率只有整條魚的46%左右，而下腳料則高達54%以上，加工利用率不高，廢棄物較多[2]，導致加工企業利潤低，難以確保羅非魚產業的持續發展，所以探索新的加工方法具有重要現實意義。利用羅非魚制造水解蛋白具有原料利用率高、水解蛋白多肽及其相關產物具有特殊生物活性和重要應用價值[3]。有關蛋白多肽的生物利用，Hara[4]較早就指出，蛋白質在消化道中的消化終產物大部分是小肽而不是游離氨基酸（FAA），這些多肽具有與原蛋白相同的氨基酸組成成分，且這類小肽具有良好的溶解性和穩定性。在此之后，開展了較多關于蛋白多肽制備及其生物活性等研究工作。目前，關于羅非魚肉蛋白的水解工藝研究的報道較少，這些研究主要是以水解度為指標，探討不同酶對羅非魚肉水解的影響，得出最佳水解酶及其最佳水解工藝條件，有的文獻還對水解產物的生理活性進行了研究[5-7]。而以水解度（DH）、三氯乙酸蛋白質氮溶解指數（TCA-NSI）、酸溶肽得率（YASP）三個參數作為羅非魚蛋白水解工藝指標，并采用響應面優化手段探究其最佳工藝條件的研究尚未見報道。本文以DH、TCA-NSI、YASP 為指標探討了羅非魚蛋白水解的最佳工藝條件并得出回歸模型，為羅非魚深加工及高級蛋白產品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚：購于市場，取其魚肉絞碎后冰箱冷凍保存，測其粗蛋白含量為18.31%、水分74.46%；Alcalase蛋白酶：天津諾維信生物技術有限公司；牛血清白蛋白：上海緣聚生物科技有限公司。

1.2 主要設備

PL403 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV2300 紫外-可見分光光度計：上海天美可惜儀器有限公司；SHZ-D 循環水式真空泵：上海精宏實驗設備有限公司；PHS-25 數顯pH 計：上海精密科學儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市子華儀器有限責任公司；飛鴿牌離心機：上海安亭科學儀器廠；SZ-93 自動雙重純水蒸流器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酶活的測定用福林酚法[8]

酶活力的定義為：在40 ℃下每分鐘水解干酪素產生1 mg/L 酪氨酸定為一個酶活力單位。

1.3.2 水解度的測定用甲醛滴定法[9]

1.3.3 三氯乙酸蛋白質氮溶解指數的測定

先用10%的TCA 沉淀羅非魚魚肉蛋白水解液中的蛋白質和大分子多肽，離心后取上清液，用甲醛滴定法測上清液中的游離氨基酸的含量[10]：

1.3.4 酸沉肽得率的測定用福林酚法[11]

1.4 酶解

稱取適量的自制魚靡加水混勻→55 ℃水浴預熱5 min →調pH →加入適量的酶→在適宜條件下水解→100 ℃水浴滅酶→冷卻→離心→抽濾分離→多肽水解液冰箱保存備用（每次實驗做三組平行）。

2 結果與討論

2.1 各單因素對魚肉蛋白水解過程的影響

2.1.1 加酶量的影響

在液固比為3 ∶1、pH8.0、溫度為50 ℃、水解時間為1 h 的條件下，分別加925.5、1 851、3 702、5 553、7 404 U/g（以羅非魚計）的酶對魚肉蛋白進行水解，結果如圖1 所示。

圖1 加酶量對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig 1 Effect of enzyme Quantity on DH，TCA-NSI and YASP

圖1 結果表明，DH、TCA-NSI 及YASP 均隨著加酶量的增加而逐漸升高，在液固比一定的情況下，隨著加酶量的增加，酶與底物接觸機會增多，酶對蛋白肽鍵的切割作用增大，DH、TCA-NSI 及YASP 均逐漸增加，如圖可知，DH 和TCA-NSI 增加幅度較大，而YASP 增加幅度較小，說明加酶量對溶液中產生游離氨基酸的影響很大而對溶液中產生多肽影響較少；當加酶量超過3 702U/g 時，隨著加酶量的增加，DH、TCA-NSI 及YASP 的增幅都趨于平緩。這是由于酶與底物的溶度已經達到了飽和，底物被酶所飽和，底物可供酶所切割位點有限，再增加酶量，DH、TCA-NSI 及YASP 不會發生太大的變化。綜合加酶量對三個指標的影響，取3 702 U/g（以羅非魚計）為最適加酶量。

2.1.2 溫度的影響

在液固比為3 ∶1、pH8.0、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計）的條件下，分別在40、45、50、55、60 ℃下進行水解1 h，結果如圖2，可以看出，在溫度為40 ℃～55 ℃范圍內，DH、TCA-NSI 和YASP 3 個指標都呈上升趨勢，當溫度超過55 ℃以后，DH、TCA-NSI 和YASP 反而呈下降趨勢，DH 值上升或下降幅度隨溫度的變化都不大，說明水解液中游離氨基酸的量基本保持不變。在酶解過程中，適當提高溫度可增強酶活力，從而促進魚肉蛋白的水解，但溫度太高則會使酶活力下降甚至有可能使酶失活，反而不利于水解。因此選擇55 ℃為適宜的水解溫度。

圖2 溫度對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.2 Effect of temperature on DH，TCA-NSI and YASP

2.1.3 pH 的影響

認識空間圖形，培養和發展學生的空間想像能力、推理論證能力、運用圖形語言進行交流的能力以及幾何直觀能力，是高中階段數學必修系列課程的基本要求.

選用不同的pH，在液固比為3 ∶1、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚計）的條件，水解1 h，結果如圖3 所示。

圖3 pH 對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.3 The effect of pH on DH，TCA-NSI and YASP

圖3 結果顯示，pH 對DH、TCA-NSI、YASP 都有一定程度的影響，在pH 達到9 時，DH、TCA-NSI、YASP都達到了最大，然后pH 超過9 之后，DH、TCA-NSI 和YASP 均呈下降趨勢，由于pH 的升高，使酶的活性下降。從圖中也可以看出pH 對YASP 的影響比較大，這可能是因為pH 比較低時，溶液中的大分子比較多，而當pH 超過8.5 時，溶液中小分子肽和氨基酸的含量開始增加。因此，取最適pH 為9。

2.1.4 液固比的影響

選用不同的液固比，在pH9.0、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚計）的條件，水解1 h，結果如圖4所示，從圖4 可以看出，隨著酶與底物比的增加，DH、TCA-NSI、YASP 都有增加趨勢，而當酶與底物比超過一定值時，DH、TCA-NSI、YASP 都有所降低，原因在于特定的酶與底物濃度比有特定的結合方式，即不同的酶與底物濃度比將有不同的產物（分子量不同）。所以在較大的酶與底物比條件下的產物中，可能含有較多的較大分子量的分子。在測定TCA-NSI 和YASP 時，這些具有較大分子量的分子的部分或者全部就會沉淀下來，根據質量守恒定律，留在溶液中的蛋白質類（即多肽）就少了，所以TCA-NSI 和YASP 都降低了，且液固比過大的話，一方面雖然使底物分散更均勻，溶解度增加，但同時酶的溶度下降，勢必對蛋白水解產成不利影響。圖中液固比為1 ∶1～3 ∶1 時，DH、TCANSI、YASP 都呈上升趨勢，但超過3 ∶1 以后，都略微的有所下降，因此取3 ∶1 為適宜的液固比。

圖4 加水量與羅非魚肉之比對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.4 The effect of liquid-to-solid ratio on DH，TCA-NSI and YASP

2.1.5 酶解時間的影響

選用液固比為3 ∶1、pH9.0、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚計）的條件，分別水解不同時間，結果如圖5 所示。

圖5 水解時間對DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.5 The effect of reaction time on DH，TCA-NSI and YASP

從圖5 可以看出，隨著酶解時間的延長，DH、TCA-NSI、YASP 都增大，在反應時間在1 h 之內，DH、TAC-NSI、YASP 的增幅較大，當時間超過1 h 之后，DH 增幅趨于平穩，TAC-NSI 不再增加，但YASP 反而有所下降，可能是由于水解越長，魚肉蛋白水解程度越大，產生的多肽被進一步水解，從而導致多肽減少，游離氨基酸的含量增加。從獲取較多多肽組分和節省能耗方面來考慮，選擇控制反應的最佳時間為1 h。

2.2 酶解工藝條件的響應面優化

表1 相應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應面分析試驗結果Table 2 Results of response surface experiment

根據以上實驗結果進行回歸擬合得到回歸方程如下。

DH 的回歸方程：

TCA-NSI 的回歸方程：

YASP 的回歸方程：

從表3 可以看出，3 個指標的回歸模型項都顯著，且失擬項不顯著，說明3 個回歸方程對試驗結果擬合得較好。從DH 模型的方差分析中可知，pH 和4 個條件的二次項顯著，說明溫度、pH、加酶量及液固比之間的交互作用對DH 無顯著影響；從TCA-NSI 模型的方差分析中可知，溫度的二次項極顯著以及交互相BC顯著，交互相BC 對TCA-NSI 的影響可從圖7 反映出；從YASP 模型的方差分析中可知，一次項C 影響顯著和二次項D2影響極顯著，交互性無顯著影響，說明溫度、pH、加酶量及液固比之間的交互作用對YASP無顯著影響。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression model

上面響應分析圖直觀反映了4 個因素以及交互作用對DH、TCA-NSI、YASP 3 個指標的影響程度。為了進一步優化酶解的最佳工藝條件，通過Design expert 7.1.6 軟件綜合3 個指標的影響，對回歸方程進行偏微分，在試驗范圍內，進行適當調整，得到最佳工藝條件為：溫度54.30 ℃，pH 為8.77，加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計），液固比為3.06：1，而在此條件下預測值DH為33.63%、TCA-NSI 為22.10%、YASP 為64.55%。從響應面分析得出的最佳條件與單因素所得出的結果總體一致。

2.3 模型的驗證性試驗

為了驗證模型的準確性，根據所得的最佳工藝條件：溫度54.30 ℃，pH 為8.77，加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計），液固比為3.06 ∶1，水解時間1 h，進行驗證試驗，在此條件下進行了3 次平行試驗（如表4 所示），測出3 次DH 的平均值為33.57%、TCA-NSI 的平均值為22.09%、YASP 的平均值為64.52%，測定結果穩定，偏差不大，數據重現性良好，證明該模型合理可靠。

圖6 各因素對DH 影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagrams for four factors on DH

圖7 各因素對TCA-NSI 影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagrams for four factors on TCA-NSI

圖8 各因素對YASP 影響的響應面圖Fig.8 Response surface diagrams for four factors on YASP

表4 驗證試驗Table 4 The test of validation

3 結論

1）單因素實驗結果可以看出，Alcalase 對羅非魚肉蛋白水解的適宜水解條件為：酶解時間1 h、液固比為3 ∶1、酶解pH 為9、酶解溫度為55 ℃、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計）。

2）用單因素所得的最佳條件進行了響應面分析，對水解工藝條件做進一步優化，得到了DH、TCA-NSI、YASP 的回歸方程模型，并通過微積分優化得出羅非魚肉蛋白水解的最佳工藝條件：溫度54.30 ℃、pH 為8.77、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚計）、液固比為3.06 ∶1、水解時間1 h，在此條件下預測值DH 為33.63%、TCANSI 為22.10%、YASP 為64.55%，實測值DH 為33.57%、TCA-NSI 為22.09%、YASP 為64.52%，預測值和實測值吻合較好，說明回歸模型能較好地預測DH、TCA-NSI、YASP 的實際指標。

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