海洋酵母內海藻糖的提取方法研究

趙玉巧，杜云建，王微，趙強

（淮海工學院海洋學院，江蘇連云港 222005）

海藻糖是由兩個葡萄糖分子組成的一個非還原性雙糖[1]，它有3 種異構體，分別是α，α-、α，β-和β，β-海藻糖，天然存在的異構體是α，α 型海藻糖[2]，廣泛存在于各種生物體中，包括細菌、酵母、真菌和藻類以及一些昆蟲、無脊椎動物和植物中。海藻糖在水中溶解性好且很穩定，在120 ℃加熱90 min 無褐變[3]，還可防御如高溫、冷凍、脫水和高滲透壓等不利環境因素，該特性已被廣泛運用于食品、化妝品、醫藥品等行業[4]，2000 年美國及聯合國糧農組織和世界衛生組織均允許海藻糖可無限量加入食品中[5]。

目前海藻糖在我國已有生產，但價格還很高，限制了它的大規模應用。用酵母生產海藻糖的關鍵技術主要是酵母中海藻糖的產量及簡單、高提取率的提取純化方法。提取海藻糖的方法有水提取法、乙醇提取法、三氯乙酸提取法及微波預處理提取法等，本文以高產量的酒香酵母為材料，系統地研究從酵母中提取海藻糖的方法，以期達到提取方法簡單、高效的目的，為酵母提取海藻糖的工業生產打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

由淮海工學院海洋生物活性物質研究實驗室從海水中篩選酒香酵母。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 斜面培養基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，補煮沸過濾陳海水至1 000 mL，pH 自然。

1.1.2.2 種子及發酵培養基

葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂0.2g，補煮沸過濾陳海水至1000mL，pH6.5。

1.1.3 培養條件

種子培養：250 mL 三角瓶裝液量為100 mL，培養溫度28 ℃，搖床轉速為150 r/min，培養時間24 h。

搖瓶培養條件：接種量為8%，培養時間60 h，其余條件與種子培養相同。

濕酵母制備：將發酵液以8 000 r/min 的速度除去上清液，加蒸餾水洗滌2 次，濕酵母放冰箱貯存待用。

1.2 方法

1.2.1 海藻糖的測定方法

硫酸-蒽酮法[6]。

1.2.2 提取率的確定

用三氯乙酸提取5 次測得的海藻糖含量總和作為酵母內海藻糖含量進行計算。

1.2.3 提取方法的研究

1.2.3.1 三氯乙酸提取

在1 g 濕酵母中加10 mL 三氯乙酸溶液（0.5 mol/L）于冰水浴中提取30 min，將提取液以8 000 r/min 的速度離心5 min，取上清液待測。重復上述步驟，共提取10 次。

1.2.3.2 超聲波輔助提取

在1 g 濕酵母中加10 mL 蒸餾水，攪拌均勻后用超聲波細胞粉碎機處理15 min，在80 ℃水浴提取60 min，離心后菌體再重復上述步驟提取4 次。

1.2.4 乙醇提取條件研究

1.2.4.1 乙醇濃度及加入量選擇

在1 g 濕酵母中分別加入乙醇濃度為50%、55%及60%水溶液各6、7、8、9、10 mL，用磁力加熱攪拌器攪拌加熱回流提取60 min，離心后菌體再重復上述步驟提取1 次，結果為兩次提取之和。

1.2.4.2 乙醇提取時間的選擇

在1 g 濕酵母中加55%乙醇9 mL，用磁力加熱攪拌器分別加熱回流提取30、60、90、120 min，離心后菌體再重復上述步驟提取1 次，結果為兩次提取之和。

1.2.5 水提取條件研究

1.2.5.1 干、濕酵母的水提取結果研究

在1 g 濕酵母及0.34 g 干酵母（相當于1 g 濕酵母）中分別加10 mL 蒸餾水并攪拌均勻，放入80 ℃的水浴鍋中提取60 min。

1.2.5.2 水加入量的選擇

在1 g 干酵母中加6、8、10、12、14 mL 蒸餾水并攪拌均勻，放入80 ℃的水浴鍋中提取60 min。

1.2.5.3 提取溫度的選擇

在1 g 干酵母中加12 mL 蒸餾水并攪拌均勻，分別在50、60、70、80、90 ℃的水浴鍋水浴提取60 min。

1.2.5.4 提取時間的選擇

在1 g 干酵母中加12 mL 蒸餾水并攪拌均勻，在90 ℃水浴鍋中分別提取15、30、45、60、75、90 min，離心后菌體再重復上述步驟提取1 次，結果為兩次提取之和。

2 結果與分析

2.1 三氯乙酸提取結果

三氯乙酸對酵母中海藻糖提取的影響見圖1。

圖1 三氯乙酸提取結果Fig.1 Result of trechioroacetic acid extraction

由圖1 中可以看出，三氯乙酸提取濕酵母中海藻糖，前三次的提取率分別為83.3%、9.6%、3.3%，前三次提取率總和達到了96.2%。后面7 次的提取總和，僅占海藻糖總量的3.8%。用三氯乙酸提取酵母中海藻糖效果較好，但考慮到三氯乙酸提取雜質多會使精制過程變得繁瑣復雜，消耗的成本非常高，另外，廢水處理復雜，從三次提取率較高的結果看，該方法用于分析海藻糖時較好。

2.2 超聲波輔助提取結果

超聲波對酵母中海藻糖輔助提取的結果見圖2。

圖2 超聲波及水提取結果Fig.2 Result of ultrasound and water extraction

從圖2 中可以看出，超聲波輔助提取濕酵母中海藻糖，第一次的提取率為95.1%，前3 次提取率總和達到了99.1%，提取效果很好，但該方法可使大量大分子物質釋放出來，純化時如果采用膜法去除大分子物質，則可簡化純化步驟降低成本。

2.3 乙醇提取條件研究結果

2.3.1 乙醇濃度及提取液體積對提取率的影響

乙醇濃度及提取液體積對酵母中海藻糖提取的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度級提取液體積對提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration and volume on extraction rate

從圖3 可以看出，采用3 種濃度的乙醇溶液提取酵母中海藻糖時，50%乙醇溶液的提取效果最差，而55%的乙醇溶液提取率在所加的提取液體積范圍內均最高。另外，隨著提取液體積的增多，海藻糖的提取率為逐漸升高的趨勢，但至提取液體積為9 mL 時，用55%的乙醇溶液做提取液其提取率升高趨勢變緩，考慮到提取液體積越多，分離時設備的體積越大，使設備成本增加，故選擇1 g 濕酵母中加入55%的乙醇溶液9 mL 進行提取。

2.3.2 提取時間對提取率的影響

提取時間對酵母中海藻糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

選擇55%乙醇作為提取液，其加入量為9 mL，考察提取時間的影響，試驗結果如圖4 所示，從圖4 可見，提取時間低于60 min 時，提取率較低，高于60 min后提取率上升緩慢，雖然120 min 提取率最高，達到83.6%，但其僅比90 min 高1.7%，考慮到生產效率及產品收率等因素，提取時間以90 min 為宜，由圖4 可見，該條件下的兩次提取率為81.9%。

2.4 水提取條件研究結果

2.4.1 干、濕酵母的水提取結果

將培養后離心得到的濕酵母與烘干后的干酵母分別進行水提取試驗，結果如表1 所示。

表1 干、濕酵母的水提取結果Table 1 Result of water extraction on dry and wet yeast

從表1 中可以看出，干酵母第一次提取的提取率遠高于濕酵母，原因可能是烘干后又加水提取的酵母，重新吸水后細胞膜及細胞壁易破裂，使海藻糖易于釋放，從干酵母第二次提取率低于濕酵母來看，也與上述推斷吻合。由兩次提取的結果可見，用干酵母加水提取其效果明顯優于濕酵母。

2.4.2 加水量對海藻糖提取的影響

加水量對海藻糖提取結果的影響見圖5 所示。

圖5 加水量對提取率的影響Fig.5 Effect of water volume on extraction rate

由圖5 可見，隨著水加入量的增多，一次提取率比總提取率上升趨勢快些，原因是提取次數越多菌體中殘留的海藻糖越少，使加水量對其影響變小。在加水量超過12 mL 后，無論是一次提取率還是總提取率上升趨勢均變緩，可見，加水量太多的話對提取率增加效果不佳，相反，加入太多的水會增加處理量，從而使設備成本增加，因此，選擇最佳加水量為12 mL較好。

2.4.3 溫度對海藻糖提取的影響

溫度對酵母中海藻糖提取的影響見圖6。

圖6 溫度對提取率的影響Fig.6 Effect of temperature on extraction rate

由圖6 可見，提取溫度高于70 ℃時，提取率較50、60 ℃有顯著增加，原因可能是溫度超過70 ℃海藻糖的溶解性及分子的擴散性均較好，但提取溫度高于70 ℃后，提取率升高趨勢變緩，當提取溫度為90 ℃時，總提取率可達81.2%，故選擇提取溫度為90 ℃。

2.4.4 水提取時間對海藻糖提取的影響

水提取時間對酵母中海藻糖提取率的影響見圖7。

圖7 水提取時間對提取率的影響Fig.7 Effect of water extraction time on extraction rate

由圖7 可以看出，隨著提取時間的延長，在提取時間為30 min 前，提取率升高很快，但30 min 后上升緩慢，當提取時間為90 min 時，提取率雖最高，但考慮到生產中生產效率必須較高，提取時間不可能無限延長，從圖7 中的結果看，提取時間為60、75、90 min時，其兩次提取率分別為79.4%、86.6%和88.7%，可見提取時間選擇75 min 即可得到較滿意的結果。

3 結論

1）用三氯乙酸提取酵母中海藻糖前三次提取率總和達到了96.2%，提取效果較好，但該方法用于工業生產有很多弊端，用于海藻糖的分析較好。

2）超聲波輔助提取酵母中海藻糖，一次提取率可達95.1%，三次總提取率為99.1%，其效果很好，但超聲波目前還不能處理大批量的物料，僅適用于小批量物料的處理，另外，其提取效果好的主要原因是使酵母細胞破碎海藻糖從細胞中釋放出來，但同時也釋放出大量的蛋白質、多糖等雜質，若用膜法處理可簡化純化步驟。

3）試驗得到乙醇水溶液的最佳提取條件為：1 g濕酵母中加入55%的乙醇溶液9 mL，提取時間90 min，該條件下的兩次提取率為81.9%。對水提取采用干酵母比濕酵母提取效果好，得到水提取的最佳條件為：1 g 干酵母中加入12 mL 水，提取溫度為90 ℃，提取時間75 min，該條件下的兩次提取率為86.6%。比較水提取與乙醇提取的結果，我們可以看出兩種方法提取率相差不大。比較提取條件可以看出，水提取的溫度高于乙醇水溶液提取，但提取時間比乙醇水溶液短?？紤]到乙醇的成本比水的成本高，回收比較麻煩，所以，對工業化大規模生產，選擇水提取方法來制備海藻糖比較適宜。

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