團頭魴微衛星多重PCR體系的建立及應用

羅偉,高澤霞,曾聰,鄧偉,易少奎,錢雪橋,王衛民

(1.華中農業大學水產學院農業動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室農業部淡水生物繁育重點實驗室,湖北武漢430070; 2.廣東海大集團股份有限公司,廣東廣州511400)

團頭魴微衛星多重PCR體系的建立及應用

羅偉1,高澤霞1,曾聰1,鄧偉1,易少奎1,錢雪橋2,王衛民1

(1.華中農業大學水產學院農業動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室農業部淡水生物繁育重點實驗室,湖北武漢430070; 2.廣東海大集團股份有限公司,廣東廣州511400)

利用團頭魴Megalobrama amblycephala20個微衛星標記組合建立了6個微衛星多重PCR體系,包括2個四重PCR和4個三重PCR體系。利用構建的6個微衛星多重PCR體系評估了團頭魴淤泥湖群體的遺傳多樣性,結果表明,平均等位基因數為5.8,平均期望雜合度和平均觀測雜合度分別為0.72和0.77,平均多態性信息含量為0.601,20個位點中有9個位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡 (P＜0.05)。本研究中篩選出的多重PCR組合為團頭魴的群體遺傳結構分析和親子鑒定等研究提供了技術基礎。

團頭魴;微衛星;多重PCR;遺傳多樣性

微衛星DNA(microsatellite)由2～6個核苷酸為核心序列的串聯重復而成,其數量巨大,隨機分布于整個基因組。自 20世紀 80年代被發現以來[1],微衛星標記以其分布廣泛、共顯性遺傳、多態性高等特點,被廣泛應用于個體鑒定、群體遺傳學,以及進化和基因組作圖等領域[2-4]。目前,應用微衛星標記對動植物進行群體遺傳和親子鑒定等的研究,通常需要對多個群體大量個體的多個微衛星位點進行PCR擴增和檢測,操作繁瑣、工作量大、試驗成本高。1988年,Chamberlian等[5]首次提出在同一PCR反應體系中加入多對微衛星引物,同時進行多個目標序列的擴增,即多重 PCR (multiplex PCR)。該技術可一次擴增多個靶位點,同時實現多個位點的基因型鑒別,使基因分型變得簡捷,提高了檢驗效率,并且多重PCR技術同時擴增兩條以上的靶基因片斷,出現假陽性的概率較常規PCR小得多,有效地減少了假陽性現象。目前,多重PCR技術已經在多個物種的群體遺傳多樣性分析[6-7]、譜系分析[8-9]和 DNA檢測[10]中被廣泛應用。在水產領域,對棕鱒[11]、大菱鲆[12]和中國明對蝦[13]等已建立了多重PCR體系。

團頭魴Megalobrama amblycephala隸屬于鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae、魴屬Megalobra-ma,俗稱武昌魚,是中國特有的經濟名貴魚類之一,原產于長江中下游的通江湖泊,由于其生長快、抗病力強、味道優美、營養豐富,自20世紀60年代人工繁殖取得成功以來,在中國各地得到廣泛推廣,目前團頭魴已成為了中國最重要的池塘混養魚類之一。幾十年來,由于原產地野生資源被過度捕撈以及各地廣泛移植和人工近親繁殖,團頭魴的種質資源不斷衰退和混雜[14]。為了保護團頭魴野生種質資源并獲得更好的良種,國家現代農業產業技術體系——大宗淡水魚類產業技術研發中心啟動了 “團頭魴種質資源與育種”項目。為實現團頭魴分子育種,目前已有不少有關其微衛星標記開發的報道[15-18],但尚未見其多重PCR體系的開發。本研究中,根據本課題組開發的多態性微衛星標記,作者優化篩選了團頭魴多重微衛星PCR擴增體系,并用于評估了團頭魴淤泥湖野生群體的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

2009年6月,采集團頭魴湖北公安淤泥湖野生群體,隨機選取40尾,剪取鰭條,用體積分數為95%的乙醇固定,于-20℃下保存備用。

1.2 方法

1.2.1 團頭魴基因組DNA的提取 團頭魴個體基因組DNA按照Tangs等[16]所用的蛋白酶K/SDS消化、苯酚-氯仿抽提法提取,將得到的DNA用雙蒸水稀釋成100 ng/μL,于-20℃下保存備用。

1.2.2 團頭魴多態性微衛星的準備 本試驗中選用的團頭魴多態性微衛星標記來自華中農業大學農業動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室已開發的團頭魴EST-SSR標記[19],基本信息見表1。

表1 用于多重PCR體系構建的微衛星位點的基本信息Tab.1 Information of the SSR loci for establishment ofmultiplex PCR system

1.2.3 團頭魴微衛星多重PCR體系的篩選和優化

在單個微衛星座位PCR的優化條件基礎上,通過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)結合硝酸銀染色進行多重PCR組合的篩選和優化。步驟如下:

1)選取帶型清晰、雜帶少的微衛星位點;

2)利用 OLIGO 7軟件 (http://www.oligo. net)檢測不同位點的引物序列間是否存在較強的互補,并選擇互補較低的引物同時進行擴增;

3)確認多個位點的產物大小兩兩之間有明顯差異,一般大于20 bp;

4)挑選引物互不干擾、產物片段差異較大的引物篩選二重PCR;

5)在條帶清晰、效果良好的二重PCR體系中添加另一對引物篩選三重PCR體系;

6)按類似方法篩選四重PCR體系。

多重PCR擴增體系為20μL,包括100 ng基因組 DNA,1×PCR緩沖液,1.5 mmol/L Mg2+,1 UTaq酶,0.2 mmol/L dNTPs,多重PCR擴增體系內各位點上、下游引物各為0.25μmol/L。PCR反應條件為:94℃下預變性5 min;94℃下變性45 s,退火45 s,72℃下延伸1 min,共進行30個循環;最后在72℃下延伸7 min,于4℃下保存備用。反應產物用于聚丙烯酰胺凝膠電泳分型。

1.3 數據處理

用PopGene 32軟件計算等位基因數 (Na)、有效等位基因數 (Ne)、觀測雜合度 (Ho)、期望雜合度 (He),多態性信息含量 (PIC)。用Genepop on the web(http://genepop.curtin.edu.au/genepop_op1.html)進行Hardy-Weinberg平衡檢驗,其P值用PHWE表示。

2 結果

2.1 多重PCR反應體系的構建

設計的引物組合經過篩選后共獲得了4個三重PCR和2個四重PCR體系,體系的引物組合、產物大小、退火溫度詳見表2。聚丙烯酰胺凝膠電泳結果見圖1。

2.2 群體遺傳多樣性

團頭魴淤泥湖野生群體的遺傳多樣性指數見表3。在野生群體中,平均等位基因為5.8,平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.77和0.72,平均多態性信息含量為0.601,20個位點中有3個位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡 (P＜0.05),有6個位點極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡 (P＜0.01)。

表2 團頭魴多重微衛星PCR體系Tab.2 The systems of m icrosatellite multiplex PCR for bluntsnout black bream Megalobrama amblycephala

3 討論

微衛星多重PCR是在同一PCR體系中同時用多個引物對同一模板進行擴增,同時檢測多個微衛星位點的基因型,可簡化試驗操作步驟和節省試驗材料,從而提高檢測效率[20]。在本試驗中,僅用6個PCR反應體系就完成了20個微衛星位點的分型,能夠在短時間內實現團頭魴群體的遺傳多樣性分析,充分體現了多重PCR操作簡便、節省材料和高效性的特點。

為了確保多個目的片段在同一個PCR反應體系中同時有特異性擴增,微衛星引物組合的選擇和PCR反應條件的優化是關鍵。引物間的兼容性(復性溫度、引物二聚體)、引物濃度、PCR緩沖液的成分和濃度,以及PCR反應體積和反應程序等是影響多重PCR擴增效率的主要因素。有學者認為,引物間的兼容性和引物濃度比例是兩個核心因素[20-21];也有一些學者認為,PCR緩沖液的成分影響多重PCR的擴增效果,而反應體積、循環次數對其擴增效果影響較小[22]。本試驗中,主要針對引物組合、退火溫度和反應體積的大小進行優化,結果發現,引物間的配對是最重要的影響因素,要選擇的引物間不能發生二聚體,濃度也不能過大,并且他們的最佳退火溫度要相近 (溫差≤5℃);此外,在同一個多重PCR反應中存在多對引物間的競爭,多重PCR中各種化學成分 (Taq酶, dNTP、DNA模板)都應高于單重PCR,同時還要降低復性溫度,并增加復性和延伸時間。

圖1 體系4-5(A)和3-7(B)聚丙烯酰胺凝膠電泳結果Fig.1 The PAGE picture of 4-5(A)and 3-7(B)

表3 淤泥湖團頭魴野生群體各SSR位點的信息Tab.3 Basic information of the SSR lociof bluntsnout black bream Megalobrama amblycephala population in Yuni Lake

生物群體的遺傳多樣性是生物多樣性的核心和本質,也是評估生物資源狀況的一個重要指標。一個種群遺傳多樣性越豐富,其環境適應能力就越強,生存和進化的潛力也就越大[23-24]。遺傳多樣性水平與生物的生長速度、抗病能力等重要經濟性狀密切相關[25]。一個種群的遺傳多樣性越豐富,從其中選出優良品種的可能性就越高,其優良性狀保持下去的潛力也就越大。本研究中采用20對Mam-EST標記分析野生團頭魴遺傳多樣性水平,發現其遺傳多樣性處于較低水平,該研究結果與其他學者的結果相似,張德春[26]運用RAPD技術研究淤泥湖和梁子湖團頭魴,認為淤泥湖和梁子湖團頭魴的遺傳多樣性均比較低;邊春媛等[27]用mtDNA控制區的RFLP研究了北方人工養殖的3個團頭魴群體,只發現2種單倍型,據此也認為其遺傳多樣性比較低,李弘華[28]使用mtDNA變異序列對梁子湖、鄱陽湖和淤泥湖3個野生群體團頭魴進行了遺傳多樣性和遺傳結構分析,結果在3個原產地的團頭魴群體中僅發現3個變異位點和5個單倍型,也認為遺傳多樣性水平較低。與同屬的魚相比,李思發等[29]通過線粒體DNA控制區分析,團頭魴的多態性低于三角魴和廣東魴。團頭魴的遺傳多樣性水平較低主要是由于其生長環境分布狹窄,僅限于長江中下游的通江湖泊,棲息環境相似,生境多態性不高,以致團頭魴進化中遺傳分化不明顯。本研究中,在野生群體的20個位點中,有9個位點顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡,這與李楊[30]的研究結果相符。該現象在多種水產動物中出現,如擬穴青蟹[31]、青蝦[32]、日本蟳[33]等,說明群體中純合子個體所占的比例較大,普遍存在雜合子缺失現象,這可能是造成群體偏離 Hardy-Weinberg平衡的主要原因。作者認為,造成多位點雜合子缺失的主要原因是由于近年來人為活動的加劇,造成團頭魴生境破碎,其繁殖受到干擾,致使團頭魴群體內部隔離;同時,人工繁殖 (特別是近親繁殖)的子代放養或人工養殖的個體逃逸到湖泊中,打破了湖泊中原有的平衡。

本研究中篩選出的微衛星多重PCR體系不僅可以應用于團頭魴群體的遺傳多樣性分析和群體遺傳關系研究,還可為親子鑒定平臺的建立以及分子標記輔助育種等方面的研究提供技術基礎。

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Establishment and application of microsatellite multilex PCR system for bluntsnout black bream Megalobrama ambl?ycephala

LUO Wei1,GAO Ze-xia1,ZENG Cong1,DENG Wei1, YIShao-kui1,QIAN Xue-qiao2,WANGWei-min1
(1.Key Lab of Agricultural Animal Genetics,Breeding and Reproduction,Ministry of Education,Key Lab of Freshwater Animal Breeding,Ministry of Agriculture,College of Fisheries,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Guangdong Haida Group Co.,Ltd.,Guangzhou 511400,China)

Six multiplex-PCR-sets including two tetraploid and four triplex combinations were developed from 20 microsatellitemarkers in bluntsnout black breamMegalobrama amblycephalabased on electrophoresis analysis of PCR products in denaturing polyacrylamide gels and visualization by silver-staining.Then genetic variability of these microsatellites was examined in wild population of bluntsnout black bream in Yuni Lake.The number of alleles at 20 loci was shown to vary from 3 to 9 with an average of5.8 alleles per locus,withmean polymorphic information content value of 0.601 and themean observed value of 0.77 and expected heterozygo site of 0.72,indicating that the bluntsnout black bream had middle level genetic diversity,and that there were 9 loci,significantly deviated from Hardy-Weinberg equilibrium(P＜0.05)in 20 loci.These optimized multiplex-PCR-sets provide a technical basis for genetic diversity study and parentage test of bluntsnout black bream.

Megalobrama amblycephala;microsatellite;multiplex PCR;genetic diversity

S917.4

A

2095-1388(2013)05-0418-06

2013-02-18

國家自然科學基金資助項目 (31201988);現代農業產業技術體系建設專項 (CARS-46-05);中央高?；究蒲袠I務費專項(2011PY023);廣東海大集團團頭魴育種專項

羅偉 (1986-),男,博士研究生。E-mail:lwdjn@live.cn

王衛民 (1959-),男,教授。E-mail:wangwm@mail.hzau.edu.cn