三維熒光光譜法測定紅酒中白藜蘆醇的含量

劉佳欣，文 震，涂志紅，何 靜，王春梅

（深圳大學化學與化工學院食品科學與工程系，廣東深圳518060）

白黎蘆醇（Resveratrol，Res）是一種二苯乙烯類化合物，化學名為3，4’，5-三羥基二苯乙烯（3，4’，5-trihydroxystilbene）（見圖1）。白藜蘆醇具有抗氧化、抗菌消炎、調節血脂、抑制腫瘤的作用，在健康食品的研究與開發中具有良好的應用前景[1-2]。白藜蘆醇主要存在于葡萄、虎杖、藜蘆、決明子和花生等天然植物及其加工制品中，尤其在紅葡萄酒中含量較高[3-4]。近年來，白藜蘆醇已成為紅酒質量標準之一，快速、靈敏、準確地檢測紅酒中白黎蘆醇含量，對紅酒生產工藝、保存條件的控制和營養評價具有重要意義[5-6]。目前白藜蘆醇的分析方法主要有紫外分光光度法、熒光分光光度法、HPLC法、RP-HPLC法、GC法等[7]。紫外分光光度法操作簡單，但干擾明顯，誤差大[8]。HPLC法結果準確，但步驟繁瑣、耗時長[9]。GC法需對樣品進行衍生化處理，前處理比較復雜[10]。熒光分光光度分析白藜蘆醇具有操作簡便、快速、結果精確的特點[11]，但傳統的二維熒光光譜并不能完整描述物質的熒光特性[12]。三維熒光光譜能夠獲得物質在激發波長和發射波長同時改變的情況下的熒光強度，較完整表達研究物質的光譜信息[13]。作為一種新型熒光分析技術，三維熒光光譜法應用于白藜蘆醇分析尚未見報道。本文研究了白藜蘆醇的三維熒光光譜特性，并以此檢測紅酒中白藜蘆醇的含量，樣品不需前處理，方法操作簡便、靈敏度高、選擇性好、且不破壞樣品，為紅酒中白藜蘆醇的直接與快速分析提供了一種新方法。

圖1 白藜蘆醇分子式與結構Fig.1 Molecular formula and structure of resveratrol

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇對照品 純度＞99%，德國Sigma公司；無水乙醇 優級純，廣州化學試劑廠；對照紅酒 深圳市食品科技協會提供；紅酒樣品 市售。

RF-5000型熒光光譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇標準溶液 取白藜蘆醇對照品100mg，用無水乙醇配制成0.1mg/mL溶液，儲于棕色容量瓶中備用。分別移取白藜蘆醇儲備溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL置于6個25mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，其中白藜蘆醇的濃度為0～2mg/L。搖勻，靜置30min，待測。

1.2.2 紅酒樣品溶液的配制 取市售干紅葡萄酒樣品1mL，用無水乙醇稀釋10倍，待用搖勻，靜置40min，待測。

1.2.3 樣品光譜特性 將白藜蘆醇標準溶液與紅酒待測液置于比色皿中，放置在熒光光譜儀中測定。儀器參數設置如下：激發波長（λex）為250～350nm，每間隔3nm讀取一個數據；發射波長（λem）為300～500nm，每間隔3nm讀取一個數據。激發和發射的狹縫寬度均為5nm，掃描速度為1200nm·min-1，PMT電壓為700V，響應時間為自動，掃描光譜進行儀器自動校正。繪制三維填充熒光光譜圖，研究白藜蘆醇及紅酒的三維熒光光譜特性，確定最大激發波長與發射波長。

1.2.4 樣品測定 在最大激發波長與發射波長處分別測定白藜蘆醇對照品與紅酒樣品的熒光強度，以熒光強度對相應的濃度作圖，繪制標準工作曲線，計算紅酒中白藜蘆醇的含量。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇熒光特征

對白藜蘆醇對照品與對照紅酒的激發與發射光譜進行掃描，將熒光強度的數據用矩陣形式表示，行和列分別對應不同的激發光波長λex和發射光波長λem，每個矩陣元素表示在波長為λex的激發光激發下發射波長為λem的熒光強度，建立激發-發射矩陣，繪制等角三維投影熒光光譜圖，結果如圖2與圖3所示。

圖2 白藜蘆醇等角三維投影熒光光譜圖Fig.2 Isometric three-dimensional fluorescence spectrometry projection of resveratrol

圖3 對照紅酒等角三維投影熒光光譜圖Fig.3 Isometric three-dimensional fluorescence spectrometry projection of reference red wine

傳統的熒光光譜只是在一定激發或發射波長下進行掃描，得到激發或發射波長與熒光強度的二維譜圖，但是實際上物質產生的熒光是激發光和發射光共同作用的結果，因此傳統的二維熒光光譜并不能完整地描述物質的熒光特性[12]。三維熒光描述了熒光強度同時隨激發波長和發射波長變化的關系，因此能完整地描述白藜蘆醇的熒光特征，并能提高對其有效熒光信息的確認與提取[14]。白藜蘆醇是非黃酮多酚類化合物（見圖1），其分子結構含有共軛雙鍵體系，呈剛性平面結構，吸光后產生π→π1*躍遷，顯示明顯的熒光特性。苯環上的酚羥基是給電子取代基，共享了共軛π電子結構，同時擴大了白藜蘆醇分子骨架的共軛雙鍵體系，提高了熒光效率。同時酚羥基助色團的存在，使得熒光光譜的波長向長波方向移動。熒光光譜掃描表明，白藜蘆醇具有單一的熒光特征發射峰，最大激發波長在290nm處，最大發射波長為380nm。而紅酒由于結構復雜，有多個熒光特征發射峰，但在λex（290nm）與λem（380nm）處，其特征發射峰周圍無其他熒光峰干擾，避免了物質間熒光譜的混疊現象，這說明紅酒中的白藜蘆醇三維熒光光譜具有指紋特性，在紅酒這一多組分的混合體系分析中發揮了優勢，為白藜蘆醇的定性與定量分析提供了依據。

2.2 標準曲線及方法檢出限

分別測定濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L的白藜蘆醇標準溶液在λex（290nm）與λem（380nm）處的熒光強度，對熒光強度/濃度進行線性擬合。在0～2.0mg/L的范圍內白藜蘆醇濃度與熒光強度呈現良好的線性相關性，線性回歸方程為Y=2472.9X+290.34，相關系數R2=0.9984。

根據IUPAC檢出限定義式，平行測定11次空白液的熒光強度。經檢出限3σ/N計算，三維熒光法測定的白藜蘆醇檢出限為2.57×10-6mg/L，表明該方法具有較好的靈敏度。

2.3 樣品測定及回收率實驗

按上述所設條件和實驗方法，對紅葡萄酒樣品溶液平行測定3次，結果見表1。

在紅酒樣品溶液中加入白藜蘆醇標樣，測定加標樣品的熒光強度，并利用線性回歸方程得出加標后溶液濃度，計算樣品的加標回收率與相對標準偏差（RSD）。表2結果表明，樣品測定的加標回收率在95.18%～100.76%之間，RSD為2.96%，表明方法準確度高，精密度好，檢測結果可靠。

表1 對照紅酒中白藜蘆醇含量的測定結果Table 1 The contents of resveratrol in reference red wine

表2 紅酒樣品加標回收率Table 2 Recoveries of resveratrol in red wine

2.4 市售紅酒樣品中白藜蘆醇含量測定

按所建方法分析市售的編號為1～6的干紅葡萄酒與7～10的紅葡萄酒，分析結果見表3。

表3 市售紅酒中白藜蘆醇含量Table 3 The contents of resveratrol in commercial red wine

由于各葡萄酒廠選用的葡萄原料的品種、生長地以及成熟季節存在差異，加上釀造工藝和保存條件的不同，所以即使是同一類型的葡萄酒其中的白藜蘆醇含量也不盡相同[5]。結果顯示，干紅葡萄酒的白藜蘆醇含量明顯高于紅葡萄酒，干紅中白藜蘆醇含量一般在0.5～2mg/L之間，部分干紅與葡萄酒白藜蘆醇含量較低，甚至不能檢出白藜蘆醇的存在。這表明，將白藜蘆醇作為紅酒的質量指標是可行的，三維熒光分析方法為實時監測紅酒的生產和存儲提供了一種準確、迅速且低成本的方法。

3 結論

3.1 獲取了白藜蘆醇對照品與紅酒的較為完整的三維熒光光譜，確定白藜蘆醇的最大激發波長λex為290nm、發射波長λem為380nm。在此λex/λem處，紅酒顯示明確的熒光特征峰，為快速測定紅酒中白藜蘆醇的含量創造了條件。

3.2 利用三維熒光光譜測定紅酒中白藜蘆醇，線性回歸方程為Y=2472.9X+290.84，相關系數R2=0.9984，檢出限為2.57×10-6mg/L，樣品的加標回收率在95.18%～100.76%之間。方法操作簡單，靈敏度高，精密度好，檢測結果準確可靠，可廣泛應用于各系列紅酒中白藜蘆醇的快速檢測與質量控制中。

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