微囊藻毒素-LR的分離純化

張淑華，王晴，陳玉娟，葛淑敏

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

隨著水體環境污染的加劇，水中有害藍藻水華事件頻繁發生，已成為國內外普遍關注的環境問題。微囊藻毒素為有害藍藻釋放的一類具有強烈促癌作用的肝毒素［1］。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是微囊藻毒素中毒性最強的一種。大量研究表明，動物肝臟是MC-LR作用的重要靶器官，可導致肝臟損傷繼而發展成肝癌。最近研究表明，除肝臟外，MC-LR也可引起生物急性腎損傷，免疫系統紊亂，甚至影響生物的生殖系統，具有遺傳毒性［2-4］。這給人體健康帶來了巨大的威脅與隱患。世界衛生組織規定飲用水中 MC-LR 的限定值為 1μg/L［5］，并于1998年正式納入飲用水標準中。我國2007年出臺的新版《生活飲用水標準》也已將微囊藻毒素列入了水質監測指標中。

目前，MC-LR的結構性質已明了。國內外對其毒性作用機制、檢測方法、治理手段、疾病治療等方面正展開積極的研究。本文利用萃取、高效液相層析法等從銅綠微囊藻中分離純化MC-LR，為MC-LR的上述相關研究提供純品。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗菌株

銅綠微囊藻FACHB905購自中國水生生物研究所。

1.2 主要試劑與器材

MC-LR標準品購自瑞士Alexis公司；硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸鈉、硼酸、氯化錳、硫酸鋅、硫酸銅、鉬酸鈉、硝酸鈷、甲醇、乙酸乙酯、乙酸等均購自北京化工廠，上述均為分析純。

高壓滅菌鍋（YXQ-LS-50A）、高速低溫離心機（Scanspeed1736R）、超凈工作臺（BJ-2CD）、超聲波細胞破碎儀（JY650）、高效液相色譜儀（Agi-lent1200）、旋轉蒸發儀（RE-2000A）、冷凍干燥機（ALPHA2-4）等均由本實驗室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 銅綠微囊藻的培養與藻細胞收集

（1）在無菌的條件下，將由中國水生生物研究所購買的FACHB905藻液平均分為兩部分，分別接入裝有30mL已滅菌的BG-11的錐形瓶中，用血細胞計數板進行計數記下初始藻細胞濃度。

（2）在室溫條件下采用自然光照靜置培養，每天定期搖動8～10次，每隔一天用血細胞計數板進行計數以掌握銅綠微囊藻的生長情況。

（3）通過血細胞計數板計算藻細胞數繪制銅綠微囊藻的生長曲線，確定其對數生長期，同時在對數生長期接種進行擴大培養。

（4）當銅綠微囊藻培養至藻細胞數最大時開始收集，將藻液于25℃下，10000rpm離心5min，收集細胞沉淀。

1.3.2 溶液萃取

（1）收集到的藻細胞沉淀按體積比1∶3加蒸餾水重懸，重懸后用超聲波進行細胞破碎，超聲波破碎條件為400W，工作3s，停頓4s，超聲100次。

（2）超聲后藻液分成兩份，分別加入等體積乙酸乙酯溶液和1.5倍體積的甲醇溶液，再次超聲，條件如（1）中所述。

（3）再次超聲后，25℃，10000rpm離心7min，添加乙酸乙酯溶液的離心管中物質分三層，取最下層水相溶液，而添加甲醇溶液的離心管中物質分兩層，取上清溶液，分別用漏斗過濾，濾液分別存放于4℃過夜。

（4）濾液重新離心，條件如（3）中所述，留取上清液，用0.22μm濾膜過濾，濾液于4℃保存。

1.3.3 MC-LR純化

（1）添加乙酸乙酯溶液萃取得到的最終濾液等體積加入甲醇溶液去除雜蛋白，25℃，10000rpm離心10min，取上清液，用0.22μm濾膜過濾，濾液即為MC-LR粗品。而直接添加甲醇溶液萃取得到的最終濾液無需經過此過程。用HPLC分別分析檢測兩種萃取方法獲得的MC-LR粗品，對比兩種溶液萃取方法的優劣。

（2）MC-LR粗品經HPLC純化，色譜條件為：

柱溫：室溫；檢測波長：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制備柱）；流動相為含有0.32%乙酸的水：甲醇（40∶60）。

（3）收集目的餾分并通過旋轉蒸發儀去除甲醇，然后進行冷凍干燥得到MC-LR純品。

2 實驗結果與討論

2.1 銅綠微囊藻的培養

圖1 銅綠微囊藻生長曲線

將由中國水生生物研究所購得的銅綠微囊藻轉接后在室溫（25℃）條件下自然光光照靜置培養，每天定期搖動8～10次，并且每天進行血細胞計數記錄細胞數，根據細胞數繪制藻細胞生長曲線如圖1所示。研究表明，處于生長期的藍藻細胞能主動釋放約40%的毒素，而大部分（60%～80%）的毒素都是在藻細胞衰老和死亡時才釋放［6］，因此確定藻細胞的生長周期對掌握收集藻細胞提取MC-LR的時期十分重要。由圖1可以看出，銅綠微囊藻開始培養后在第5d進入對數生長期，培養到第8d時細胞數最大，進入穩定期（穩定期是代謝產物尤其是次級代謝產物產生的主要時期）。第9d左右開始出現生長下降趨勢。根據細胞在對數生長期生長最快的原理，試驗中取培養6d的藻液轉接新鮮培養液中進行擴大培養（比例為1∶8），由于細胞進入衰亡期后期會出現自溶現象，為后續分離帶來很大的麻煩，所以綜合考慮后確定，藻細胞大量收集的最佳時間為培養后第8-9d，收集足夠多的藻細胞后進行MC-LR提取。

2.2 MC-LR的提取

將收集的藻細胞用超聲波破碎儀破碎。超聲波破碎時的時間和功率及破碎過程中產生的熱量對MC-LR的提取效率及生物活性均有影響，經試驗分析采用400W，工作3s，停頓4s，超聲100次的操作方式綜合效果最好。

收集破碎藻液，分別采用乙酸乙酯-甲醇和甲醇作為萃取劑進行萃取，將兩種萃取方法獲得的MC-LR粗提液的HPLC色譜圖與MC-LR標準品的HPLC色譜圖進行對比分析發現，由乙酸乙酯萃取除去雜質再用甲醇除雜蛋白的效果比直接用甲醇溶液進行萃取的效果好，雜質較少。這可能是因為甲醇極性較大，萃取后溶液中含有可溶于甲醇的極性強和極性弱的雜質，而先加極性較弱的乙酸乙酯可去除極性較弱的雜質。因此，選用乙酸乙酯-甲醇這種萃取方法獲得的MC-LR粗提液進行進一步純化效果較好。

2.3 MC-LR的純化

經乙酸乙酯-甲醇萃取后得到的粗提液采用高效液相色譜法進行進一步純化，經條件摸索得到純化條件為柱溫：室溫；檢測波長：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制備柱）；流動相為含有0.32%乙酸的水：甲醇（40∶60）。經與MC-LR標準品的HPLC分析圖譜（圖2）相比，上述條件下MC-LR純化效果（圖3）較理想。收集目的餾分，通過旋轉蒸發除去甲醇，再經冷凍干燥獲得純品固體粉末，純度可達94%。

圖2 MC-LR標準品高效液相色譜圖

圖3 MC-LR純品高效液相色譜圖

3 結論

通過培養銅綠微囊藻和血細胞計數板計算細胞數，觀察銅綠微囊藻的生長周期，確定其第5d進入對數生長期，第6d進行移種擴大培養，接種比例為1∶8，第8d藻細胞數量最大，藻細胞大量收集的最佳時期為銅綠微囊藻培養后的第8-9d，之后用于MC-LR的提取。

將收集到的藻細胞采用超聲波細胞破碎儀在400W，工作3s，停頓4s，超聲100次的條件下進行細胞破碎，然后對乙酸乙酯-甲醇和甲醇兩種溶劑萃取方法的萃取效果進行比較，得出先用乙酸乙酯萃取細胞破碎液中極性較弱的雜質，再用甲醇除雜蛋白的除雜效果較好。對經乙酸乙酯-甲醇溶劑萃取得到的MC-LR粗提液進行過濾，并采用HPLC進行進一步純化，純化條件為柱溫：室溫；檢測波長：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制備柱）；流動相為含有0.32%乙酸的水：甲醇（40：60）。最終經冷凍干燥獲得MC-LR純品，經分析純度可達94%。

本文分離純化得到的MC-LR可用于MC-LR毒性作用機制、MC-LR所致水體污染檢測及水體污染治理等相關方面的研究，為水體環境的檢測、保護及人體健康等方面提供有效服務。

［1］Dawson R M.The toxicology of microcystins［J］.Toxicon，1998，36（7）：953-962.

［2］Liu Y D，Song L R，Li X Y.The toxic effects of microcystin-LR on embryo-larval and juvenile development of loach，Misgurunsm izolepis Gunthe.［J］.Toxicol，2002，40（4）：395-399.

［3］CHEN J，XIE P.Tissue distributions and seasonal dynamics of the hepatotoxic microcystins-LR and-RR in two freshwater shrimps，palaemon modestus and macrobrach iumnipponensis，from a large shallow，eutrophic lake of the subtropical China［J］.Toxicon，2005，45（5）：615-625.

［4］CHEN J，XIE P，GUO L，et al.Tissue distributions and seasonal dynamics of the hepatotoxic microcys-tins-LR and-RR in a freshwater snail（Bellamya aerugino sa） from a large shallow，eutrophic lake of the subtropical China［J］.Environ Pollut，2005，134（3）：423-430.

［5］World Health Organization.Guidelines for Drinking Water Quality［R］.Switzerland：Health Organization，Geneva，1998.