橙黃決明素的制備及其與牛血清白蛋白的相互作用

寇自農，徐龍權

(大連工業大學 現代教育技術部，遼寧 大連 116034)

0 引 言

橙黃決明素(Aurantio－obtusin)是豆科植物決明子(CassiaobtusifoliaL.)或小決明子(CassiatoraL.)中的一種蒽醌類化合物[1－3]，被《中國藥典》確定為決明子藥材TLC、HPLC檢測主要標示物，具有降血脂、降血糖等藥理活性。外源化合物和血清白蛋白相互作用是實現藥物運輸和發揮藥效的主要方式。熒光光譜法已經被用來研究黃芩苷、茜素、丹參素、丹酚酸A、橙皮苷等與牛和人血清白蛋白的相互作用[4－7]。探討橙黃決明素與血清白蛋白的相互作用，對于闡述橙黃決明素的藥物作用機理具有重要意義。本文采用硅膠真空液相層析從決明子中分離制備橙黃決明素，根據化合物的理化性質和波譜數據鑒定其化學結構。采用熒光光譜法研究橙黃決明素和牛血清白蛋白的相互作用，評價橙黃決明素和牛血清白蛋白的結合及其特性。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

JC－84多功能提取罐；真空液相層析柱；X－5型顯微熔點儀；UltiMate3000高效液相色譜；UPLC－QTOF－MS 液 質 聯 用 儀；C13－NMR、H1－NMR，瑞士 Bruker，400MHz；LS－55熒光光譜儀；LAMBDA 35紫外－可見分光光度計；pHS－3C型酸度計；旋轉蒸發儀。

決明子藥材，四川溫江；薄層硅膠板GF254；層析硅膠，青島海洋化工廠；乙腈，色譜純；磷酸、氨水、硫酸，分析純，天津市科密歐化學試劑公司；丙酮、氯仿、石油醚、乙酸乙酯，工業級。決明子藥材經鑒定為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.干燥種子。橙黃決明素溶液：橙黃決明素用95%的乙醇溶解，用水稀釋成2.5×104mol／L的貯備液；牛血清白蛋白，Sigma公司，純度＞95%，用pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液配制成5.0×10－5mol／L貯備液；水為二次蒸餾水。

1.2 方 法

1.2.1 HPLC與TLC分析條件

Hypersil ODS2色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，大連依利特分析儀器公司；流動相，A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液；流動相梯度，0～30min(25%A)，30～60min(25% ～70%A)，60～70min(70% ～100%A)；體 積 流 量，1.0mL／min；檢測波長，280nm[3]；UPLC－QTOF／MS 分 析，色 譜 柱 BEH－C18(100mm ×2.1mm，1.7μm)；體積流量，0.25mL／min。流動相，乙腈(A)和0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫，0～60min，0～100%A；正離子模式檢測，氮氣作霧化氣，氬氣作碰撞氣；毛細管電壓，±3kV；離子源溫度，120℃；毛細管溫度，350℃；脫溶劑氣體積流量，800L／h，錐孔氣體積流量，50L／h；錐孔電壓，正離子35V；正離子能量，25～50eV；質譜檢測掃描范圍(m／z)，100～1 000；TLC展開劑，V(石油醚)∶V(丙酮)＝3∶1，氨氣熏蒸顯色[8]。

1.2.2 提取與分離

20kg決明子藥材用80L甲醇回流提取3次，得到甲醇提取物。將提取物溶入20L4%硫酸水溶液，90℃水浴加熱水解4h，用20L乙酸乙酯萃取3次，得到橙黃決明素粗提物。粗提物在硅膠真空液相層析柱上以氯仿洗脫，TLC檢測收集含橙黃決明素部分，合并濃縮；第2次真空液相層析分離用V(石油醚)∶V(丙酮)＝100∶0～9∶1梯度洗脫，TLC檢測收集橙黃決明素部分，合并蒸干得到橙黃決明素。將橙黃決明素用V(石油醚)∶V(丙酮)＝9∶1溶液重結晶得到純品。

1.2.3 結構鑒定

用顯微熔點儀測定樣品熔點。UPLCQTOF－MS和 NMR 測定樣品分子質量。用C13－NMR、H1－NMR譜，鑒定化合物的結構[1]。

1.2.4 光譜分析

在10mL刻度試管中依次加入0.5mL 5.0×10－5mol／L的BSA溶液和0.05～0.35mL 2.5×10－4mol／L的橙黃決明素溶液，用pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液稀釋定容至5mL。分別在25、37、47℃3種溫度下恒溫10min，掃描各個溫度下的熒光光譜、同步熒光光譜和三維熒光光譜；在10mL刻度試管中分別加入0.5mL 5.0×10－5mol／L BSA溶液，依次加入0.1～0.3mL 2.5×10－4mol／L橙黃決明素溶液，用pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液稀釋定容至5mL，搖勻。在紫外分光光度計上進行紫外光譜掃描。

2 結果與討論

2.1 提取與分離

20kg決明子藥材經甲醇提取、硫酸水溶液水解、乙酸乙酯萃取后得到橙黃決明素粗提物3kg。HPLC分析甲醇提取物和水解物的色譜圖如圖1所示。結果表明，水解后強極性化合物明顯減少，橙黃決明素含量明顯提高，應該是橙黃決明素苷在酸性條件下水解為橙黃決明素。采用水解－萃取的方法有利于提高橙黃決明素的提取得率。

圖1 決明子甲醇提取及水解物液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of methanol extract and extract hydrolysate fromCassia obtusifolia L.

粗提物分別采用氯仿－丙酮和石油醚－丙酮體系作為洗脫劑，以硅膠真空液相層析法進行二次分離，得到橙黃決明素粗品10.5g。V(石油醚)∶V(丙酮)＝9∶1溶液進行重結晶，干燥后得到橙黃決明素8.2g。

2.2 結構鑒定

橙黃色結晶(石油醚－丙酮)，mp 242～243℃。ESI－MSm／z：331.067 1([M＋H]＋)；1H－NMR(ACETONE－d6，400MHz)δ：2.83(3H，s，6－CH3)，3.97，3.94(3H，s，2，8－OCH3)，7.87(1H，s，H－4)，9.15(1H，brs，7－OH)，9.36(1H，brs，3－OH)，(1H，s，1－OH)。13C－NMR(ACETONE－d6，400MHz)δ：15.66(C－6)，59.98，61.20(2，8－OCH3)，107.29(C－5)，111.88(C－9a)，123.83(C－8a)，125.91(C－4a)，126.04(C－4)，129.29(C－6)，131.82(C－10a)，139.44(C－2)，147.18(C－7)，155.15(C－3)，156.20(C－1)，157.19(C－8)，180.43(C－10)，187.80(C－9)。以上數據與文獻[1]一致，確定化合物為橙黃決明素。

2.3 橙黃決明素對BSA熒光的猝滅作用

BSA中含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等殘基，激發波長280nm時，其發射光波長一般位于350nm附近，不同濃度橙黃決明素與BSA作用的熒光光譜圖見圖2。從圖2可以看出，隨著橙黃決明素濃度的增加，BSA熒光光譜熒光強度逐漸下降，但最大波長與峰形無明顯的變化，說明橙黃決明素對BSA產生了熒光猝滅作用。

圖2 橙黃決明素對BSA的熒光淬滅作用光譜圖Fig.2 Fluorescence quenching spectra of aurantio－obtusin to BSA

2.4 橙黃決明素對BSA熒光的猝滅機理

熒光猝滅過程通常分為靜態猝滅和動態猝滅。靜態猝滅主要是熒光分子與猝滅劑之間形成了不發光的配合物，動態猝滅主要是熒光分子和猝滅劑分子之間相互碰撞的結果，其作用過程符合Stem－Volmer方程

式中：F0和F分別為不加和加入猝滅劑后蛋白的熒光強度；cA為猝滅劑濃度；Kq為擴散碰撞猝滅速率常數；τ0為無猝滅劑時熒光分了的熒光壽命，一般生物大分子的熒光壽命為10－8s；KSV為Stem－Volmer猝滅常數，其本質是雙分子猝滅速率常數與單分子衰變速率常數的比率，反映了2種衰變途徑之間的競爭。當不同溫度下的KSV有明顯變化時，其熒光猝滅應該是基于分子間相互碰撞的動態猝滅方式，反之則為靜態猝滅。分別考察了25、37、47℃下不同濃度橙黃決明素BSA熒光強度的變化，以F0／F分別對橙黃決明素濃度cA曲線擬合的結果見圖3。25、37、47℃3個溫度下的Kq和KSV見表1。從圖3和表1可以看出，隨著溫度的升高，3個溫度條件下的Stem－Volmer方程得到猝滅常數KSV變化不明顯，初步判斷橙黃決明素對BSA熒光猝滅為靜態猝滅，其猝滅速率常數Kq為1.412×1013L／(mol·s)，遠大于猝滅劑對生物大分子的最大碰撞猝滅常數2.0×1010L／(mol·s)[5]，進一步證明橙黃決明素對BSA熒光不是由于動態碰撞引起，只能是靜態猝滅方式。

圖3 橙黃決明素與BSA的Stem－Volmer曲線Fig.3 Stem－Volmer curves for the binding of aurantio－obtusin and BSA

表1 橙黃決明素與BSA作用的結合特性及熱力學參數Tab.1 The binding property and thermodynamic parameters of aurantio－obtusin and BSA

BSA紫外吸收光譜隨猝滅劑加入的變化也是研究猝滅機理重要方法，動態猝滅并不改變蛋白吸收光譜，靜態猝滅由于生成基態配合物可能引起吸收光譜的變化。橙黃決明素對牛血清白蛋白紫外吸收光譜的影響見圖4。

圖4 橙黃決明素對牛血清白蛋白紫外吸收光譜的影響Fig.4 The effect of aurantio－obtusin on absorption spectrum of BSA

由圖4可知，隨著橙黃決明素的增加，BSA的218、280nm處特征吸收峰峰形與波長無明顯變化，在315nm處新增加一個吸收峰，且吸收峰強度逐漸增大，可能是橙黃決明素與BSA結合形成了基態配合物，進一步證明了橙黃決明素對BSA的熒光猝滅為靜態猝滅。

2.5 橙黃決明素與BSA結合特性和結合常數

對于靜態猝滅，橙黃決明素與BSA結合常數和特性可以通過公式(2～4)來進行計算[5]。

采用不同溫度下的lg[(F0－F)／F]對lgcA作圖，直線截距和斜率分別為橙黃決明素與BSA分子間的結合常數Ka及結合位點數n。3個溫度下方程式分別為：y＝1.050 3x＋5.376 3(R2＝0.997 7，25℃)；y＝1.175 9x＋5.952 0(R2＝0.997 1，37℃)；y＝0.999 2x＋5.104 7(R2＝0.988 6，47℃)。計算結果見表1。從表1可以看出，橙黃決明素與BSA分子結合，其ΔH＞0，ΔS＞0，說明兩者結合是疏水作用力，這與橙黃決明素是極性相對較弱的蒽醌類化合物有關；而ΔG＜0，說明兩者結合是一個自由能降低的自發過程。

2.6 橙黃決明素對牛血清白蛋白構象的影響

2.6.1 同步熒光譜的分析

藥物分子對蛋白質構象的影響可采用同步熒光光譜分析。Δλ＝15、60nm的同步熒光光譜分別顯示蛋白質中酪氨酸(a)和色氨酸(b)殘基的光譜特性。圖5為橙黃決明素與BSA相互作用的同步熒光光譜，由圖5可以看出，固定BSA濃度隨著橙黃決明素的增加，酪氨酸、色氨酸殘基的熒光猝滅效應明顯，但色氨酸的發射波長沒有明顯變化，酪氨酸的發射波長由286nm向左藍移至283nm?？赡苁浅赛S決明素與酪氨酸的疏水性結合改變了其周圍環境，提高了疏水性，引起了蛋白質構象的變化[5]。

圖5 橙黃決明素與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of BSA in the presence of aurantio－obtusin

2.6.2 三維熒光光譜的分析

BSA和BSA加入猝滅劑的三維熒光光譜及等高線見圖6。圖6(a)，(b)中的峰1(λex＝λem)是溶液瑞利散射光譜，橙黃決明素加入前后，其強度變化不明顯，說明橙黃決明素與BSA的結合并未影響蛋白分子的大小變化。由圖(a)，(b)，(c)，(d)均可以看到反映BSA酪氨酸和色氨酸殘基的熒光峰2，主峰為λex／λem＝281nm／350nm，次峰為λex／λem＝230nm／340nm，峰2的主次峰強度在橙黃決明素加入后都明顯減弱，說明橙黃決明素加入不僅使酪氨酸和色氨酸殘基熒光發生了猝滅，其多肽骨架熒光λex／λem＝230nm／340nm 熒光也有所降低。

圖6 BSA(a)、(c)與BSA－aurantio－obtusin(b)、(d)三維熒光光譜及等高線圖Fig.6 Three－dimensional fluorescence and contour spectra of BSA (a)，(c)and BSA－aurantio－obtusin(b)，(d)

3 結 論

采用硅膠真空液相層析從決明子中分離制備了橙黃決明素。橙黃決明素對牛血清白蛋白有明顯的熒光猝滅作用且熒光猝滅屬于靜態猝滅。橙黃決明素與牛血清白蛋白的結合位點數為1，與BSA之間的結合主要是以疏水作用力相結合的自發過程。橙黃決明素與牛血清白蛋白的酪氨酸的疏水性結合可能引起了蛋白質構象的變化，但牛血清白蛋白分子的大小并未有明顯的變化。

[1]郝延軍，桑育黎，趙余慶.決明子蒽醌類化學成分研究[J].中草藥，2003，34(1)：18－19.

[2]戴迎春，鄧楠，劉文，等.決明子中橙黃決明素的提取、分離及純化方法的研究[J].中南藥學，2011，9(3)：179－182.

[3]胡軼娟，朱軍，萬麗.決明子 HPLC指紋圖譜研究[J].中國中醫藥科技，2008，15(5)：365－367.

[4]劉彩虹，李玉琴，賈寶秀，等.黃芩苷與人血清白蛋白的相互作用研究[J].分析測試學報，2011，30(5)：532－536.

[5]GE Feng，JIANG Lixiang，LIU Diqiu，et al.Interaction between alizarin and human serum albumin by fluorescence spectroscopy[J].Analytical Sciences，2011，27：79－84.

[6]張曦，寇自農，石羽佳，等.同步熒光光譜法研究丹參素－牛血清白蛋白體系的熒光增強效應[J].分析測試學報，2011，30(4)：444－447.

[7]張曦，寇自農，石羽佳，等.丹酚酸A對牛血清白蛋白的熒光猝滅作用[J].大連工業大學學報，2012，31(2)：95－97.(ZHANG Xi，KOU Zinong，SHI Yujia，et al.Fluorescence quench to bovine serum albumin by Sal A[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2012，31(2)：95－97.)

[8]胡軼娟，萬麗，張加雄，等.決明子藥材薄層色譜鑒別研究[J].時珍國醫國藥，2006，17(11)：2129.