大孔樹脂HPD300分離純化樟樹果色素的研究

崔夫知，李 霞*，董新榮，夏東海，何麗娜

（湖南農業大學 理學院，湖南 長沙 410128）

樟樹是我國特產的經濟樹種，樹干、枝葉及果實中含有多種具有應用價值的化合物。如果實中的樟油是香料香精、醫藥和日用化工的重要原料[1]。成熟的樟樹果為紫黑色，含有大量的原花青素[2]。原花青素是一種有著特殊分子結構的聚多酚類混合物[3]，具有保護心血管、預防高血壓、抗腫瘤、抗輻射、抗突變以及美容等功效[4]。原花青素還可清除體內的自由基，具有良好的抗氧化活性[5-6]。有關原花青色素的提取分離的研究較多，主要提取方法有水提取法、傳統溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界CO2萃取法、酶提取法[7]，分離純化方法有溶劑分級精制[8]、吸附層析法[9]。目前，人們對樟樹果紫色素的研究還較少。文赤夫等[10]報道樟樹果中原花青素具有較好的清除自由基的效果。桂克印等[11]報道酸性水提取、D406樹脂吸附、pH6的酸性乙醇洗脫純化樟樹果色素的方法。

本實驗采用常溫條件下超聲波輔助乙醇提取新鮮樟樹果肉中的紫色素，進一步以大孔樹脂HPD300進行吸附，再用體積分數30%的乙醇洗脫得到紫色素產品。全過程不添加酸性物質，有利于保證產品的純天然性，而且樣品中原花青素含量高，為樟樹果中的原花青素的開發利用提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹果11月下旬采摘于湖南農業大學校園內，洗凈去核取果皮。HPD100、HPD100A、HPD300、HPD400、HPD600、HPD750大孔吸附樹脂：河北寶恩生物科技有限公司；原花青素（純度≥98%）對照樣品：長沙三福生物科技有限公司。

香草醛、乙醇、甲醇、鹽酸、香草醛等試劑：天津市科密歐化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學儀器廠；SB25-12DTN超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；AX-200型萬分之一電子天平：日本Shimadzu Philippines公司）；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；UV-160可見光分光光度計：北京瑞利分析儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制及樣品的測定

（1）標準溶液的配制

準確稱取原花青素對照樣品3.21mg，甲醇溶解，轉入25mL容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，配制成原花青素標準儲備溶液，濃度c=0.1284mg/mL。

（2）顯色溶劑的配制

由A液和B液兩種顯色劑按1∶1的體積比混合配成，現配現用。A液（1%的香草醛溶液）：稱取0.5g香草醛用甲醇溶解并定容至50mL，搖勻備用；B液（8%的濃鹽酸）：量取4.0mL濃鹽酸，用甲醇定容至50mL，搖勻備用。

（3）標準曲線的繪制

分別移取1.5mL、2.5mL、3.5mL、4.5mL、5.5mL原花青素標準溶液于10mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，得到系列對照樣溶液。然后，分別移取此系列溶液1mL于比色管中，同時另取1mL甲醇為空白對照，精密加入5mL顯色劑。搖勻，避光，在30℃恒溫水浴顯色30min，冷卻后在波長494nm處測定吸光度值。以吸光度值（Y）對質量濃度（x）作標準曲線。

（4）樣品的測定

稱取樣品適量，甲醇溶解，定容。按（2）、（3）方法測定吸光度值，然后計算物質的量。

1.3.2 樟樹鮮果肉中原花青素的提取與上樣溶液的制備

稱取新鮮去核樟樹鮮果肉150g，用70%vol乙醇300mL浸泡15min，25℃超聲提取10min，過濾，收集濾液。濾渣再重復提取兩次，合并3次提取后的濾液，減壓回收乙醇，殘留液加入蒸餾水超聲溶解，過濾，稀釋至950mL，得到上樣液。

1.3.3 大孔樹脂靜態吸附與解吸附

稱取6種處理干凈的大孔吸附樹脂各1g（以濾紙吸干水分后晾干），放入100mL的具塞的錐形瓶中，加入50mL上樣液后放入25℃的水浴振蕩器中以110r/min轉速振搖，每間隔1h取上清液一次，測其吸光度值并計算其靜態吸附量。

將吸附了色素的樹脂過濾，分別用5mL蒸餾水洗去樹脂表面的殘留液。再將吸附色素的樹脂放入具塞錐形瓶中，加入20mL 95%vol乙醇在振蕩器上振搖洗脫2h，取洗脫液測定其吸光度值，計算解吸附量和解吸附率。色素在樹脂上的靜態吸附量及解吸附率按式（1）及（2）計算。

式中：C解吸液為解吸液中色素的質量濃度，mg/mL；V解吸液為解吸溶液的體積，mL；Q吸附為平衡吸附量，mg/g。

式中：Q吸附為平衡吸附量，mg/g；V上樣液為上樣液的體積，mL；C原上樣液為上樣液色素的起始質量濃度，mg/mL；C吸附后溶液為色素吸附平衡起始質量濃度，mg/mL；m樹脂為樹脂的質量，g。

1.3.4 樹脂動態吸附與洗脫

將處理好的吸附樹脂11.6g（以濾紙吸干水分后晾干，柱床體積約20mL）裝入一支50mL的酸式滴定管內，以1BV/h的速度上樣，測定流出液的吸光度，直至吸附飽和。然后，以2BV的蒸餾水洗滌樹脂床，再分別以體積分數為10%、30%、50%、70%、95%的乙醇進行梯度洗脫，以每15min接10mL洗脫液為一管。按式（3）計算樹脂的動態飽和吸附量（mg/g）。

式中：Q飽和吸附量為樹脂的色素飽和吸附量，mg/g；C上樣液為上樣液色素的起始質量濃度，mg/mL；V上樣液為上樣液的體積，mL；C流出液為流出液色素的質量濃度，mg/mL；V流出液為流出液的體積，mL；m樹脂為樹脂的質量，g。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

原花青素的含量一般采用鹽酸-香草醛比色法測定[12]。首先將原花青素溶液顯色后用紫外光譜儀在波長190nm～600nm范圍內掃描以確定最大吸收波長，得到最大吸收波長為494nm，結果與文獻一致[13]。然后，按實驗方法測定系列標準溶液的吸光度值，以吸光度值（Y）對濃度（x）繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 Standard curve of procyanidins

圖1結果表明，原花青素在0.1926g/L～0.7062g/L范圍內具有良好的線性關系，Y=-0.02855+1.1628x，相關系數R=0.9991（n=5）。

2.2 大孔樹脂靜態吸附與解吸附

為了考察大孔樹脂對樟樹果肉中紫色素的吸附效果，首先對6種樹脂進行了靜態吸附與解吸附試驗篩選。6種樹脂分別與一定濃度的樟樹果肉紫色素提取液混合振搖，每間隔1h取上清液在波長494nm處測定其吸光度值，共吸附5h，靜態吸附后上清液吸光度值變化的結果見圖2。

由圖2可知，實驗中所用的6種樹脂在吸附時間3h后上清液吸光度值下降變慢，即說明6種樹脂已將趨于吸附飽和。其中HPD300、HPD100、HPD750三種樹脂的上清液吸光度值最低，即HPD300、HPD100、HPD750樹脂對樟樹果肉中紫色素具有較好的吸附作用。計算結果表明，樹脂HPD100、HPD300、HPD750在靜態吸附5h后的飽和吸附量分別為48.46mg/g、53.85mg/g、47.56mg/g。

圖2 6種大孔樹脂對樟樹果肉紫色素的靜態吸附曲線Fig.2 Static adsorption curve of procyanidins on six different resins

吸附在樹脂上的紫色素需要容易洗脫下來，才具有實際應用價值。對6種吸附了紫色素的樹脂用體積分數95%乙醇進行靜態解吸附實驗，取上清液測定洗脫溶液的吸光度值以評價其解吸附效果。結果表明，紫色素在3種樹脂HPD100、HPD300、HPD750上的的洗脫量分別為39.01mg/g、43.71mg/g、37.33mg/g，即解吸附率分別為80.50%、81.17%、78.48%。

由圖2可以看出，樹脂HPD300對樟樹果肉紫色素的靜態吸附量及解吸附率均較好，因此選用HPD300進行樟樹果肉中原花青素的動態吸附研究。

2.3 大孔樹脂HPD300動態吸附曲線

以樹脂HPD300裝入一支體積為50mL的酸式滴定管中，控制上樣液流速為1BV/h，每0.5BV（10mL）接收1管，測定流出液吸光度值，繪制其動態吸附曲線見圖3。

圖3 紫色素在HPD300樹脂上的動態吸附曲線Fig.3 Dynamic adsorption curve of procyanidins on resin HPD300

由圖3可知，隨著上樣量的增大，流出液中紫色素含量逐漸增加，當上樣體積超過1500mL，HPD300樹脂對樟樹果色素的吸附量迅速降低；當上樣體積達到3200mL，流出液中樟樹果色素的含量與上樣液中含量基本相同，此時HPD300樹脂吸附樟樹果肉紫色素達到飽和。通過計算，HPD300樹脂對樟樹果肉紫色素的動態飽和吸附量達到66.34mg/g。

2.4 大孔樹脂HPD300乙醇梯度動態洗脫

上述飽和吸附紫色素的HPD300樹脂用蒸餾水洗滌除去表面的殘留上樣液后，以乙醇梯度洗脫，每個梯度的乙醇用量以洗至流出液色淡為止，洗脫液按0.5BV（10mL）接收1管，以乙醇適當稀釋后測定其吸光度。為了直觀對比不同體積分數的乙醇對紫色素的洗脫效果，將其所測定的吸光度值乘以稀釋倍數后進行比較，結果見圖4。

圖4 乙醇梯度洗脫曲線Fig.4 Elution curve by different concentration of ethanol

由圖4可知，吸附在樹脂上的紫色素主要由3BV左右的體積分數30%的乙醇洗脫下來。

為了進一步比較不同濃度的乙醇對吸附在HPD300樹脂上的紫色素的洗脫效果以及紫色素的純化效果，將各濃度乙醇梯度洗脫的溶液合并回收溶劑，得到粉末狀樣品，各樣品的質量及樣品中原花青色素的含量（以葡萄皮原花青素為對照樣品進行測定）見表1。

表1 HPD300分離樟樹果肉紫色素的結果Table 1 Results of separation of proanthocyanidins by macroporous resin HPD300

由表1可知，吸附在樹脂上的物質主要由體積分數為30%、50%的乙醇洗脫下來。上樣后HPD300樹脂吸附色素的總量為771.96mg，洗脫總量為755.60mg，總洗脫率97.88%，其中體積分數30%的乙醇洗脫率為66.43%，洗脫物中原花青素的含量達到97.54%（以葡萄皮中原花青素計），為上樣液中原花青素含量（5.77%）的16.8倍。

原花青素通常以酸性水溶液或酸性醇溶液提取[14-16]，提取液調節pH值后以大孔樹脂吸附，再在酸性條件下進行上樣吸附和洗脫進而達到純化目的[17-18]。酸水提取雖然提取效率高，但也存在環境污染、影響產品的“純天然性”等問題，而且酸性溶液一般還會影響原花青素在大孔樹脂上的吸附效果。桂克印等[11]用酸性水提取樟樹果肉的原花青素，以大孔樹脂D406吸附pH=3的上樣溶液、再以pH=6的體積分數50%的乙醇洗脫達到純化色素的目的，結果色素的純化倍數為4.8倍。本實驗在室溫下以乙醇為溶劑、超聲輔助提取樟樹果肉的原花青素，提取液經減壓回收乙醇后加適量水稀釋后制成原上樣液；然后以大孔吸附樹脂HPD300上樣吸附，以乙醇梯度洗脫色素。結果表明，樟樹果肉的原花青素在大孔樹脂HPD300上的吸附量大，色素主要由體積分數30%的乙醇洗脫下來，純化后樣品不僅原花青素的含量高，而且為天然的紫色；樹脂床經體積分數70%的乙醇洗脫后回歸為樹脂的原有白色，可直接循環使用。

3 結論

本實驗首先以靜態篩選方法，從6種大孔樹脂中篩選出對樟樹果肉紫色素吸附與洗脫效果較好的HPD300樹脂，然后對其進行了樹脂動態吸附與乙醇梯度洗脫的實驗。結果表明，樹脂HPD300對樟樹果肉紫色素的動態飽和吸附量為66.34mg/g樹脂，紫色素主要由體積分數30%的乙醇洗脫洗脫下來，洗脫率為66.43%，洗脫物中原花青素的含量可達到97.54%。樹脂床經體積分數70%的乙醇洗脫即可再生，總洗脫率達到97.88%。該方法顯示樟樹果肉紫色素在大孔樹脂HPD300上的吸附量大、樣品中原花青素含量高、產品純天然等特點，為樟樹果中紫色素的開發利用提供了參考。

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