解酯假絲酵母脂肪酶的性質及固定化

張 健, 鄭 來 久, 薛 永 常

( 大連工業大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

脂肪酶(EC3.1.1.3,Lipase)是一種水解酶,能夠在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交換及立體異構體拆分等化學反應[1],存在于動物、植物及許多微生物中,目前已被廣泛應用于皮革、皮毛、絹紡、食品、醫藥等行業[2]。

我國工業化生產解酯假絲酵母脂肪酶已有幾十年的歷史。徐巖等[3]曾對其酶學性質進行了研究,但由于產酶菌種的不同,酶學性質也會發生很大的變化。作者以解酯假絲酵母為出發菌種,對其發酵產生的脂肪酶粗酶進行了性質研究,同時對其固定化進行了初步探索。

1 實 驗

1.1 材 料

解酯假絲酵母(Candidalipolytica),本實驗室保藏；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 脂肪酶粗酶液的制備

將新鮮的解酯假絲酵母種子接到發酵培養基中,28 ℃、160 r/min條件下搖床培養30 h,將發酵所得的發酵液在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min,取上清液即為所需脂肪酶粗酶液[4]。

1.2.2 脂肪酶水解活力的測定

脂肪酶活力的測定采用堿滴定法[5]。酶活定義:在40 ℃、pH 7.5條件下,每分鐘水解產生1 μmol脂肪酸的酶量定義為一個脂肪酶單位。

1.2.3 酶的最適溫度與最適pH測定

最適溫度:將脂肪酶的游離酶和固定化酶分別放到不同的溫度下,測定其各自的酶活力(pH控制為7.5)。

最適pH:在40 ℃下,改變磷酸緩沖液的pH,在不同的pH條件下測定脂肪酶游離酶和固定化酶的酶活。

1.2.4 硅藻土固定化酶的制備

將制備的脂肪酶粗酶液進行鹽析,冷凍干燥,加到相應的緩沖液中,攪拌充分溶解,然后將定量硅藻土加入到酶液中,恒溫攪拌一段時間后離心收集固體,冷凍干燥即為所制得的固定化酶。

2 結果與討論

2.1 解酯假絲酵母產脂肪酶粗酶液的酶學性質

2.1.1 酶的最適反應溫度

測定了30～55 ℃該脂肪酶粗酶液的酶活,以最高酶活為100%繪制相對酶活曲線。從圖1可以看出,溫度對脂肪酶粗酶液的酶活影響較大,在40 ℃時表現出最高酶活力,當溫度再升高5 ℃時,酶活迅速降低,其相對酶活只有30%左右,說明酶液的熱穩定性較差。

圖1 脂肪酶的最適反應溫度

2.1.2 酶的最適反應pH

測定了pH 5.0～8.5該脂肪酶粗酶液的酶活,以最高酶活為100%繪制相對酶活曲線。從圖2可看出，當pH達到7.5時,脂肪酶的酶活最大。由此可見,該脂肪酶的最適反應pH為7.5。

圖2 脂肪酶的最適反應pH

2.1.3 酶的熱穩定性研究

將粗酶液在40、50、60 ℃水浴中分別保溫100 min,每隔20 min測一次酶活。由圖3可見,粗酶液在40 ℃下保溫20 min后,沒有明顯失活。40 ℃保溫100 min,仍能保留60%左右的酶活；在50 ℃下,100 min后可以保留約30%的酶活；在60 ℃情況下,粗酶液的酶活迅速下降,60 min后,酶活只有20%左右,在100 min后酶活為0。

圖3 脂肪酶的熱穩定性

2.1.4 酶的pH穩定性研究

取酶液與不同pH (5.0～9.0)的緩沖液以1∶5比例混合,在4 ℃保育48 h,再將酶液pH調回到7.5,按標準酶活法測定殘留酶活力,結果如圖4所示。該酶在pH 6.0～8.0活力損失較小,在其他pH范圍內酶活損失較大。

圖4 脂肪酶的pH穩定性

2.2 脂肪酶的固定化條件

2.2.1 給酶量對酶固定化的影響

在脂肪酶的固定化過程中,加入的酶量對固定化酶活性影響較大。在最適固定化作用時間、溫度和pH下考察了載體與酶量的比例對酶固定化的影響。圖5表明,隨著硅藻土用量的相對增加,固定化酶的催化活力逐漸升高,當硅藻土超過一定量時,單位固定化酶催化活力降低。當載體與脂肪酶的質量之比為14時,固定化脂肪酶催化活力最高。

2.2.2 溫度對酶固定化的影響

在脂肪酶的固定化過程中,溫度會影響酶的活性,在脂肪酶固定化時合適溫度很重要。在最適pH為8.0下,按一定比例將載體與脂肪酶溶液混合,在20～45 ℃對脂肪酶進行固定化,時間為2 h。圖6表明隨著溫度的升高,固定化脂肪酶的催化活力逐漸增加,當溫度大于30 ℃時,隨著溫度的升高,酶的催化活力反而降低。因此本實驗中脂肪酶的最適固定化溫度為30 ℃。

圖5 載體與酶量的比例對酶固定化的影響

Fig.5 Effect of the ratio of diatomite to lipase on immobilized lipase

圖6 溫度對固定化效果的影響

2.2.3 緩沖液pH對酶固定化的影響

在脂肪酶的固定化過程中,緩沖液的pH可改變酶和載體的離子化狀態,是影響其催化活力和載體吸附酶分子的重要因素[6]。圖7表明,利用硅藻土在偏堿性的條件下(7.5

圖7 緩沖液pH對酶固定化的影響

2.2.4 時間對固定化酶的影響

在最佳條件下,采用不同的固定化時間,制得固定化酶的酶活力如圖8所示。在起始階段,隨著固定化時間的延長,酶活逐漸升高,當固定化時間大于2 h,酶活開始下降。

圖8 時間對固定化酶的影響

3 結 論

解酯假絲酵母發酵產脂肪酶粗酶液的最適作用溫度為40 ℃,最適pH為7.5,pH 6.0～8.0酶活損失較少,在40 ℃保存100 min后仍能保留60%左右的酶活；在50 ℃下,100 min后可以保留約30%的酶活；在60 ℃情況下,100 min后酶活為0。

利用硅藻土吸附法對脂肪酶進行固定化,固定化的最佳條件為:載體與脂肪酶質量比為14,固定化溫度為30 ℃,緩沖液pH為8.0,固定化時間為2 h。

[1] 王智,高仁鈞,楊碩,等. 有機相中脂肪酶催化拆分環氧丙醇的研究[J]. 吉林大學自然科學學報, 2001(1):81-84.

[2] 宋欣. 微生物酶轉化技術[M]. 北京:化學工業出版社, 2004:123.

[3] 徐巖,李建波,王棟. 解脂假絲酵母脂肪酶的純化及性質研究[J]. 無錫輕工大學學報, 2001, 20(3):257-260.

[4] 王麗麗,高忠濤,杜冰,等. 基于響應面法優化生物酶洗毛工藝[J]. 毛紡科技, 2010, 38(7):9-14.

[5] PERALTA J M, RUBIOLO A C, ZORRILLA S E. Design and construction of a hydrofluidization system. Study of the heat transfer on a stationary sphere[J]. Journal of Food Engineering, 2009, 90(3):358-364.

[6] 高貴,韓四平,王智,等. 硅藻土固定化脂肪酶[J]. 吉林大學學報:理學版, 2002(3):324-326.