發光二極管紅光對實驗性高脂血癥大鼠血脂的調節作用①

盧建麗，劉翠霞，尹昱，安經克，賈子善

高脂血癥是臨床上的常見病，多發病，與心腦血管疾病的發生密切相關，如何安全有效地降低血脂已成為臨床研究的熱點。有研究表明，低強度激光照射治療可以降低血脂含量[1]，改善血液流變學[2]。發光二極管(LED)紅光波長390～670 nm，與低強度激光的波長范圍相似，且具有功耗低、易集成、可靠性高、發光光譜單色性好、波段范圍寬等特點[3]。本科小樣本臨床試驗初步顯示，LED紅光在調節血脂方面有一定的作用。為此，我們在建立大鼠高脂血癥模型的基礎上，觀察LED紅光照射對高脂血癥大鼠血脂的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級近交系雄性Sprague-Dawley大鼠36只，8周齡，體重218～287 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2006-0009。每籠5只，清潔級飼養環境，溫度18～22℃，濕度50%～60%。所有大鼠適應性喂養普通飼料1周后，隨機分為正常對照組(n=12)和高脂模型組(n=24)。正常對照組喂普通飼料，高脂模型組喂高脂飼料。高脂飼料喂養6周后，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，內眥靜脈叢取血，分離血清，測定空腹血清膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL-C)含量。兩組間有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，造模成功。見表1。造模成功后再將高脂模型組大鼠隨機分為高脂對照組和LED治療組。

表1 高脂飲食6周時血脂水平(mmol/L)

1.2 高脂飼料配方

2%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、77.8%普通飼料按比例計算出所需量，于河北醫科大學實驗動物學部統一加工而成。普通飼料購自河北醫科大學實驗動物學部。

1.3 主要試劑及儀器

TC試劑、TG試劑、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL-C)試劑、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL-C)試劑、總酯酶試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：201011，201011，2010019，2010028，20110322；兔抗大鼠羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reducase,HMG-CR)多克隆抗體：Santa Cruz公司，批號：10210；紅光治療儀(PKHGY-Ⅱ型)：河北普康醫療設備有限公司。

1.4 LED照射

將LED治療組大鼠放到自制的鼠籠中(120×60×60 mm)，鼠籠置紅光治療儀光頭上，使光頭對準大鼠的腹部，每次照射30 min，每天1次，連續照射28 d。照射期間各組喂養飼料不變。

1.5 血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的測定

分別于照射前和照射第29天，大鼠禁食12 h后，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射，內眥靜脈叢取血，3000 r/min離心10 min，分離血清，用半自動生化分析儀(德國豪邁)測定TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。

1.6 血漿脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和肝脂酶(hepatic lipase,HL)的測定

于照射后第29天，大鼠尾靜脈注射肝素130 U/kg[4]，15 min后內眥靜脈叢采血，制備血漿。參照改良的Krauss和Blache的方法[5-7]，在37℃、pH=8.3的條件下，將肝素后血漿與底物(脂肪乳劑)一起保溫30 min，血漿中的LPL和HL可將底物中的TG水解為甘油和游離脂肪酸(FFA)。用銅試劑法測定生成的FFA量，即可分別計算出LPL和HL的活性。

1.7 免疫組織化學染色

于照射后第29天，大鼠禁食12 h，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，留取所需的血液標本后腹主動脈放血處死大鼠，立即取出肝臟，冰生理鹽水漂洗3次，濾紙吸干，在肝臟最大葉距邊緣1 cm處取1×1×1 cm肝組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚5 μm。將各組切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，高壓熱抗原修復，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加HMG-CR抗體(1∶75)，4℃冰箱過夜。用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 min，加DBA顯色液，室溫下反應，顯微鏡下染色充分，PBS漂洗，蘇木素復染，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每張切片選取5個視野，用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統，在同一光強度、同一放大倍數下進行圖像分析，分別記錄每張切片的陽性細胞數分級及陽性細胞顯色強度(5個視野的均值)，并進行總評分[8]。

陽 性 細 胞 數 分 級 (A)： 0～1%=0， 1%～10%=1，10%～50%=2，50%～80%=3，80%～100%=4。

陽性細胞數顯色強度分級(B)：0=陰性，1=弱陽性，2=陽性，3=強陽性。

總評分(IHS)=A×B

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 血清TC、TG、LDL-C和HDL-C

照射前，LED治療組與高脂對照組血清TC、TG、HDL-C和LDL-C均無顯著性差異。照射后，與高脂對照組相比，LED治療組血清TC、TG和LDL-C明顯降低(P＜0.01)，HDL-C 明顯升高(P＜0.01)。見表2、表3。

2.2 血漿LPL、HL活性

照射28 d后，高脂對照組大鼠血漿LPL、HL的活性低于正常對照組(P＜0.05)；LED治療組大鼠血漿LPL、HL活性明顯高于高脂對照組(P＜0.01)；LED治療組大鼠血漿LPL、HL的活性高于正常對照組，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

表2 LED紅光照射前各組血脂水平(mmol/L)

2.3 HMG-CR

HMG-CR陽性部位在肝細胞胞漿內，呈棕黃色。見圖1。正常對照組大鼠肝臟中央靜脈及匯管區周圍可見散在分布的陽性細胞，免疫組化評分(1.9±0.99)。高脂對照組大鼠肝臟中央靜脈及匯管區周圍可見較多陽性細胞，免疫組化評分(3.8±1.99)，高于正常對照組(t=-2.70,P=0.02)。LED治療組陽性細胞數少，免疫組化評分(2.1±1.29)，低于高脂對照組(t=-2.27,P=0.04)。

表3 LED紅光照射后各組血脂水平(mmol/L)

表4 LED紅光照射后各組血漿LPL、HL活性(U/ml)

圖1 各組HMG-CR表達(免疫組織化學染色，100×)

3 討論

紅光是指用物理學方法濾去對皮膚有損害作用的紫外線和具有明顯熱效應的紅外線，僅保留600～700 nm波段的紅光，其主要作用是光化學作用，而并非熱效應。

目前臨床上應用的紅光大多為低強度激光。LED紅光作為一種新型的光源，其波長范圍與低強度激光相同，且具有成本低、節能、光束面積大等優點，正廣泛應用于醫療照明、美容及腫瘤治療等領域，而應用LED紅光調節血脂的相關研究，國內外還比較少見。

有研究表明，血漿脂質濃度的高低與脂蛋白代謝密切相關，調節影響脂蛋白代謝的酶活性即可調節血漿脂質濃度[9]。LPL和HL是脂質代謝過程中兩個關鍵酶，其缺陷或活性降低，均可導致甘油三酯血癥水平升高。

LPL可以催化乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL-C)核心的TG分解為脂肪酸和單酰甘油酯，以供組織氧化和貯存。同時還參與VLDL和HDL間的載脂蛋白和磷脂的轉換。LPL活性的增強可影響血漿中TG和膽固醇(TC、LDL-C、HDL-C、VLDL-C等)的水平，從而調節血漿中脂蛋白的代謝，降低高脂血癥的發生[10-11]。

HL是血液中內源性TG代謝的關鍵酶之一。研究表明，HL可水解CM、VLDL-C和LDL-C，釋放出FFA[12]，還可以選擇性作用于HDL2，水解其中的甘油三酯和磷脂，有助于肝攝取HDL2中膽固醇及膽固醇酯，在膽固醇的逆向轉運中起重要作用[13]。

LED紅光照射可以增加高脂血癥大鼠血清LPL和HL的活性，可促進甘油三酯的水解和膽固醇的逆向轉運，進而發揮調節血脂的作用。

HMG-CR是膽固醇合成過程中的限速酶，它存在于胞漿及滑面內質網膜上。抑制HMG-CR活性，能減少膽固醇合成時，促使細胞消耗儲存的膽固醇，進而促使肝細胞增加LDL-C受體的數量與活性，加強對血液中LDL-C的攝取利用，從而將低血中總膽固醇及LDL-C，同時影響其他脂類的代謝。

我們推測，LED紅光照射可能會抑制肝臟HMG-CR，使血清膽固醇濃度降低。LED紅光如何作用于HMG-CR，機制尚不清楚，有待于進一步研究。

[1]池景泉,胡桂芳,林湘,等.低強度激光鼻腔內照射對血脂異常作用的研究[J].激光生物學報,2005,14(4)：265-268.

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[3]Sazonv AM,Romanov GA,Portnoy LM.Low intensity non-coherent red light in the complex treatment of peptic ulcer[J].Ulcer Soviet Medicine,1985,12：42-46.

[4]張琪,馬博,朱玲玲,等.銀杏葉提取物對實驗性高脂血癥大鼠的調節機制[J].華西藥學雜志,2007,22(6)：605-608.

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