Delta-like 4在胰腺癌中的表達及其意義

張偉杰 徐桂芳 周志華 田志強 鄒曉平

·論著·

Delta-like 4在胰腺癌中的表達及其意義

張偉杰 徐桂芳 周志華 田志強 鄒曉平

目的檢測Delta-like 4(DLL4)在胰腺癌中的表達，探討其臨床意義。方法采用免疫組化法檢測60例胰腺癌組織中DLL4的表達，行血管內皮特異性標志物CD34免疫染色，計算微血管密度(MVD)；分析它們的相關性及其與胰腺癌臨床病理特征、患者預后的關系。結果DLL4在胰腺癌組織中的表達明顯高于正常胰腺組織(68.3%比20.0%,χ2=14.239,P<0.01)，其高表達與胰腺癌的腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及累及范圍密切相關，與腫瘤大小、部位、病理分型無關。胰腺癌組織MVD明顯高于正常胰腺組織(34.9±13.2比18.9±2.2,t=3.570,P<0.01)，其與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及累及范圍密切相關，與腫瘤大小、部位及病理分型無關。DLL4陽性表達與預后密切相關。經Cox模型分析，TNM分期、DLL4陽性表達是胰腺癌患者預后不良的獨立危險因素。結論DLL4的高表達在胰腺癌轉移、浸潤中起重要作用。腫瘤DLL4表達和TNM分期對評估胰腺癌患者的預后有一定價值。

胰腺腫瘤； Delta-like 4； 微血管密度； 免疫組織化學； 預后

Delta-like 4(DLL4)是哺乳動物中一個主要與Notch1相互作用的Notch配體[1]，可以活化Notch信號，在腫瘤血管的新生、發育和成熟過程中起主要作用[2]。惡性膠質瘤及前列腺癌的腫瘤細胞過表達DLL4，并促進腫瘤的生長[3]。本實驗檢測胰腺癌組織DLL4的表達及其與微血管密度(microvessel density, MVD)的關系，探討DLL4在判斷胰腺癌患者預后中的價值。

材料和方法

一、研究對象

收集南京鼓樓醫院2000年10月至2002年8月手術切除的60例胰腺癌標本，其中男42例，女18例，年齡39～72歲，中位年齡63歲。取其中20例腫瘤邊緣處的正常胰腺組織作為對照。病理診斷與分類依據國際抗癌聯合會的TNM分類。

二、DLL4蛋白及MVD檢測

采用免疫組化染色法檢測組織DLL4的表達和MVD。兔抗人DLL4多抗購自Abcam公司，工作濃度1∶10；兔抗人CD34多抗購自福州邁新公司，工作濃度1∶100；鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶超敏試劑盒和二氨聯苯胺酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司，按試劑盒說明書操作。用PBS替代一抗作空白對照。

每張切片由兩位病理醫師盲法分別讀片及評分。胞質中出現棕黃色顆粒為DLL4陽性染色。每張切片選取5個400倍視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，計算陽性細胞數百分比。陽性細胞數<10%為陰性(-)，10%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為中度陽性(++)，>50%為強陽性(+++)。CD34表達于血管內皮細胞膜，每一個染成棕黃色的，可與周圍血管、腫瘤細胞及其他結締組織區分開來的明顯微小血管腔或含3個以上內皮細胞的內皮細胞簇，不論管腔和紅細胞出現與否，均作為一個單一的可計數的微血管。管腔面積>8個紅細胞直徑、帶有較厚肌層的微血管均不計數[4]。先于低倍鏡下確定3個血管著色最密集區域，然后在200倍視野下計數微血管的數目，取均值作為MVD。

三、統計學處理

用log-rank檢驗，影響預后因素采用多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、胰腺癌組織DLL4表達及其與腫瘤臨床病理特征的關系

胰腺癌組織DLL4的陽性表達率為68.3%(41/60)，癌旁正常胰腺組織表達率為20.0%(4/20，圖1)，兩者差異具有統計學意義(χ2=14.239，P<0.01)。胰腺癌組織DLL4表達與腫瘤分化程度、T分期、TNM分期、淋巴結轉移相關，而與患者年齡、性別及腫瘤部位、大小、病理分型無關(表1)。

圖1 胰腺癌(a)和癌旁組織(b)的DLL4表達(×400)

二、胰腺癌組織MVD及其與腫瘤臨床病理特征的關系

胰腺癌組織的MVD為34.9±13.2，癌旁正常胰腺組織為18.9±2.2(圖2)，兩者差異具有統計學意義(t=3.570，P<0.01)。胰腺癌組織MVD與腫瘤分化程度、T分期、TNM分期、淋巴結轉移相關，與患者年齡、性別及腫瘤部位、大小、病理分型無關(表1)。

圖2 胰腺癌(a)和癌旁組織(b)的CD34表達(×400)

三、胰腺癌組織DLL4表達與MVD的關系

胰腺癌組織DLL4表達與MVD呈顯著正相關(r=0.669，P<0.05)。

表1 胰腺癌組織DLL4表達、MVD與臨床病理特征的關系

四、胰腺癌組織DLL4表達與患者預后的關系

60例患者隨訪截止日期為2004年1月。期間失訪3例，病死50例。 57例患者中位生存時間為301 d，1年生存率為30.5%(圖3a)。DLL4陰性患者的中位生存時間為569.5 d，1年生存率為66.7%；DLL4陽性患者中位生存時間218 d，1年生存率為20.5%(圖3b)，DLL4陰性胰腺癌患者的預后明顯好于DLL4陽性組患者(P<0.01)。

圖3 胰腺癌組織DLL4表達與患者生存關系

運用Cox模型對可能影響患者預后的因素進行分析，結果表明，DLL4表達量、TNM分期為影響胰腺癌患者預后的獨立因素(表 2)。

表2 胰腺癌預后相關因素的多因素分析

討 論

DLL4是Notch信號通路中的一個重要配體，與腫瘤血管生成有關。哺乳動物細胞中Notch信號通路包含了5種跨膜Notch配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)和4種Notch受體(Notch1～4)[1]。血管內皮細胞表達Notch1和Notch4受體及jagged1、DLL1和DLL4配體。腫瘤血管和腫瘤細胞也高表達DLL4，可以活化Notch信號[5-6]。本研究結果顯示，胰腺癌組織高表達DLL4，且與腫瘤組織MVD呈顯著正相關，與胰腺癌的浸潤深度呈正相關，提示DLL4的過表達與胰腺癌的侵襲和轉移能力密切相關。

抑制腫瘤組織中DLL4的過度表達將使腫瘤組織生成大量無功能的新生血管，造成腫瘤組織血供不足，最終導致腫瘤生長受到抑制[7-9]。Li等[10]報道，抗DLL4抗體可以特異性阻斷Notch信號通路，抑制腫瘤生長，并減少腫瘤啟動細胞的發生率。新近研究發現，特異性地阻斷DLL4信號通路能夠抑制胰腺癌腫瘤血管生成，進而抑制腫瘤生長[11]。

MVD是衡量血管生成的定量指標。MVD與多種腫瘤生長轉移相關。Ikeda等[12]通過單因素和多因素研究認為，MVD可作為影響胰腺癌預后的獨立因素。章福彬等[13]認為，MVD與臨床病理特征關系密切，且與疾病進展階段呈正相關。本結果顯示，胰腺癌組織MVD明顯升高，提示胰腺癌是一種血管豐富的惡性腫瘤。

本研究中，DLL4陽性表達患者的中位生存時間明顯短于DLL4陰性患者，與Chen等[14]研究結果相似。

總之，DLL4的表達在胰腺癌的血管生成過程中起著重要作用，與胰腺癌的轉移、浸潤密切相關，其表達可作為判斷胰腺癌預后的一個有意義指標。

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[14] Chen HT, Cai QC, Zheng JM, et al.High Expression of Delta-Like Ligand 4 Predicts Poor Prognosis After Curative Resection for Pancreatic Cancer. Ann Surg Oncol, 2012,19:S464-S474.

(本文編輯：屠振興)

補充說明

本刊2012(6)期“小型豬不同程度阻塞性慢性胰腺炎模型建立及其CT表現”一文作者單位：寧波大學醫學院附屬醫院影像科(汪建華)；第二軍醫大學長海醫院核醫學科(汪建華、左長京、張建、孫高峰、茅娟莉、潘桂霞、彭燁)，放射科(李曉棟)，病理科(鄭建明)；復旦大學醫學院附屬華山醫院放射科(馮曉源)。通信作者：馮曉源：Email:cjr.fengxiaoyuan@vip.163.com?；痦椖浚荷虾Ｊ锌莆蒲谢?10410708800)，中國博士后科學基金(20100480545)，浙江省醫藥衛生科技計劃項目(2012KYB176)，寧波市自然基金(2010A610052)。特此補充，順致歉意！

ExpressionandroleofDelta-like4inpancreaticcancer

ZHANGWei-jie,XUGui-fang,ZHOUZhi-hua,TIANZhi-qiang,ZOUXiao-ping.

DepartmentofScienceandTechnology,DrumTowerHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the expression of Delta-like 4 (DLL4) in pancreatic cancer and its clinical significance.MethodsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was examined by immunohistochemistry method. The microvessel density (MVD) was calculated after CD34staining specifically for microvessel endothelium; and their correlations and relationship between them and clinicopathological parameters as well as prognosis of pancreatic carcinoma was investigated.ResultsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was significantly higher than that in normal pancreatic tissue (68.3%vs20%,P<0.01). The over-expression of DLL4 in pancreatic cancer was related to degree of differentiation, TNM staging, lymph node metastasis and invasion depth, while not related to the size, location and histological types. The MVD in pancreatic cancer tissues was notably higher than that in normal tissues (34.9±13.2vs18.9±2.2,P<0.01). MVD was correlated to degree of differentiation, lymph node metastasis, but not related to the size, location and histological types. DLL4 expression was closely associated with prognosis．COX model analysis showed that TNM staging and DLL4 expression were independent prognostic factors for pancreatic cancer.ConclusionsThe over-expressions of DLL4 may play an important role in metastasis and invasion of pancreatic cancer. Expression of DLL4 and TNM staging is useful for predicting the prognosis of patients with pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms； Delta-like 4； Microvessel density; Immunohischemistry； Prognosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.007

南京大學中央高?？蒲匈Y助項目(021414340038)

210008 南京，南京大學附屬鼓樓醫院科技處(張偉杰)，消化內科(徐桂芳、鄒曉平)；解放軍第101醫院病理科(周志華)，普外科(田志強)

鄒曉平，Email:zouxiaoping795@hotmail.com

2012-04-06)