殼寡糖鑭配合物的抑菌活性及其與牛血清白蛋白的相互作用

馮小強，李小芳，楊 聲

1天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水741001;2定西師范高等?？茖W校，甘肅定西743000

殼寡糖(簡稱COS)是殼聚糖通過化學法、酶法等解聚而成的低分子殼聚糖，一般由2～50個糖單元通過糖苷鍵連接而成，不僅水溶性大，而且具有獨特的生理活性如抗菌性、抗腫瘤性、抗氧化性、降血脂性、調節免疫等。COS分子中由于氨基和羥基的存在而對過渡金屬和稀土離子有著穩定的配位作用。近年來，有關COS過渡金屬配合物的報道不斷涌現，如與 Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+等離子的配位，而有關COS稀土配合物的研究卻少有報道。稀土元素由于特殊的外層電子構型，具有發光［1］、抗炎、殺菌、抗癌、抗凝血、鎮痛等作用［2］。任群翔等制備了COS與Pr3+、Dy3+的配合物，發現配合物對羥自由基具有明顯的清除作用，與COS相比對羥自由基具有更高的抑制活性［3］;中心離子 Nd3+與COS4個鏈節單元上的氨基N和仲羥基O結合，形成八配位的殼寡糖-釹配位聚合物［4］。本文合成了殼寡糖-La(簡稱COS-La)配合物，并對其結構和性質進行了表征?？疾霤OS、COS-La對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌活性，發現COS、COS-La對這金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有較強的抑菌活性，且COS-La的抑菌活性強于COS，故COS-La是一種潛在的抑菌藥物。

各種藥物進入血液循環后需要通過血漿的存儲和運輸，才能到達受體部位而發揮相應的藥理作用［5］。藥物在血漿中都會與血漿蛋白結合，對藥物在體內的代謝和分布產生重要影響，而血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質。因此，研究藥物與血清白蛋白的作用機制，這對于了解藥物在體內的運輸和分布情況具有很重要的意義。本實驗并采用紫外光譜、熒光光譜和循環伏安曲線法研究COS-La與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用機理。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

殼寡糖(分子量10000，濟南海德貝海洋生物工程有限公司);LaCl3(甘肅稀土新材料股份有限公司);牛血清白蛋白(BSA)(北京奧博星生物技術責任有限公司，C=10-5mol/L的溶液);大腸桿菌ATCC 35218(E．coli)、金黃色葡萄球菌ATCC 26113(St．aureaus)由天水市中醫醫院化驗科提供。

Spectrum One 3.0傅立葉紅外光譜儀(Perkin Elmere公司);UV-2450紫外可見光譜儀(日本島津);TG-DTA分析儀(Perkin Elmere公司);RF-5301PC熒光光譜儀(日本島津);DSX-280B型不銹鋼自動手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠);ZDP-2120型全自動新型電熱培養箱(上海智城分析儀器制造有限公司);ZHJH-2109B超凈工作臺。CHI-612C電化學工作站(上海辰華儀器公司);三電極體系:碳糊電極(CPE)為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。

1.2 COS-La配合物的制備

分別稱取1.0 g COS、1.5 g LaCl3加入到50 mL蒸餾水中，在60℃下攪拌回流6 h，冷卻至室溫后，在上述混合液中倒入3倍體積的丙酮，即刻產生沉淀，沉淀陳化過夜，抽濾，用φ =0.95的乙醇反復洗滌至濾液中無氯離子存在(滴加少許硝酸銀溶液，直到無白色沉淀產生即可)，60℃干燥得COSLa。

1.3 抑菌實驗

將固體培養基高溫滅菌30 min倒平板，用無菌水分別稀釋金黃色葡萄球菌、大腸桿菌制得OD610nm=0.1的菌懸液，在每個平板中加入0.1 mL菌懸液，涂平板。將浸泡在5 mg/mL COS、COS-La溶液中直徑為6 mm的濾紙片貼在細菌培養基上，以1.0%HAc做空白對照組，在37℃下恒溫培養24 h(E．coli)、48 h(St．aureus)。

1.4 COS-La與BSA的相互作用

在一系列試管中分別加入1.0 mL BSA溶液和一定量的濃度為5 mg/mL的COS-La溶液，以二次蒸餾水定容至5.0 mL，室溫下作用12 h，200 ～600 nm范圍掃描紫外吸收光譜;設定λex=280 nm，EX=EM=3 nm，掃描熒光發射光譜;電極處理后放入0.5 mol/L(pH 6.8)的Tris-HCl緩沖溶液中，加入適量的COS-La與BSA，與未加BSA的COS-La溶液比較，于電位-1.2～1.2 V下以掃速100 mV/s進行掃描，用循環伏安法對該體系進行測定。

2 結果與討論

2.1 COS-La表征

COS、COS-La的紅外光譜如圖1所示。COS原位于3445 cm-1左右的-OH和-NH特征吸收峰配位后峰形變窄，說明COS中-OH和-NH可能參與配位;原位于1083 cm-1處仲羥基伸縮振動吸收峰，配位后位移至1069 cm-1;1598 cm-1的伯胺N-H面內彎曲振動強吸收峰移至1603 cm-1左右，進一步證明COS中仲羥基-OH和-NH參與配位。另外，配合物在774 cm-1處產生尖而強的吸收峰，歸屬為O-La吸收。因此COS中-NH2上的N原子與仲羥基上的O原子參與配位。

濃度為1.0 mg/mL的COS、COS-La溶液紫外光譜如圖2所示。COS在223.5 nm和275.5 nm處有兩個較強吸收峰，而COS-La除了在222.8 nm和274.0 nm有兩個吸收峰，還在341 nm處有一弱吸收峰，這可能是COS-La中氧、氮某一元素或二種元素的孤對電子發生n-σ*躍遷，從而導致電子光譜發生變化。由此表明COS與La3+發生了配位作用。

以α-Al2O3為參比，以10℃/min速率升溫至800℃，對產物進行熱力學分析。COS的熱分解可分為三個階段:第一階段分解在50℃，主要脫去水分，失重率為15.8%，在97.8℃有一強放熱峰;第二階段是在200～340℃失重率為42.9%，是COS分解、氧化、燃燒的結果，歸屬為糖環的脫水、聚合物單元的解聚的綜合結果，在217℃有一強放熱峰;第三階段在600℃左右又出現弱放熱峰，熱重曲線還呈下降趨勢，當溫度升到800℃時，COS分解和氧化完全。而 COS-La最大失重在175～360℃，在253.3℃有一強放熱峰，當溫度升到800℃時，樣品質量還剩45%，最終的氧化產物為三氧化二鑭。熱重數據表明COS-La熱穩定性不如COS，是由于在多聚糖結構中-OH和-NH2參與配位，一定程度上減弱了COS分子間氫鍵的形成，進而此次級轉變的轉變溫度略有降低。

圖3 COS(A)、CS-La(B)的 TG 圖Fig.3 TG images of COS(A)and COS-La(B)

2.2 COS-La的抑菌活性

COS、COS-La對黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌圈如圖4所示?？梢钥闯鯟OS、COS-La對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌均具有抑菌效果，且COS-La抑菌效果好于COS的，說明稀土離子與殼寡糖具有協同作用，使得配合物抑菌效果增強。

圖4 COS-La(1)、COS(2)、1.0%HAc(3)對黃色葡萄球菌(A)、大腸桿菌(B)的抑菌圈Fig.4 Inhibition zone of COS-La(1)，COS(2)and 1.0%HAc(3)against St．aureus(A)，E．coli(B)

2.3 COS-La與BSA的相互作用

2.3.1 熒光光譜

BSA分子中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能夠發熒光，其熒光光譜變化情況可直接反映分子中熒光生色團的結構和所處微環境及分布情況。圖5為COS-La對BSA熒光強度的影響。在激發波長為280 nm時，BSA在339nm出現發射峰。在BSA溶液中依次加入COS-La，隨著COS-La濃度的增大，BSA的熒光強度依次減弱，表明COS-La對BSA的熒光具有猝滅作用。

圖5 COS-La對BSA熒光強度的影響(CBSA=2×10-6 mol/L)Fig.5 Fluorescence spectra of BSA with various concentrations of COS-La

熒光猝滅過程分為動態猝滅和靜態猝滅。通過采用Stern-Volmer方程來分析BCS-Eu對BSA的熒光猝滅過程類型。

Stern-Volmer方程:

其中，F0為未加入猝滅劑時的熒光強度;F為加入猝滅劑后的熒光強度;Kq(L/mol·s)為雙分子猝滅過程的速率常數，Kqгo=KSV(L/mol)稱為Stern-Volmer猝滅常數:［Q］為猝滅劑的濃度;гo為沒有猝滅劑存在時熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s。根據(1)式，以F0/F-1對COS-La濃度［Q］作圖，得Stern-Volmer猝滅曲線，如圖6a所示，滿足方程Y=-0.05+0.55x。通常各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅常數為2.0×1010L/mol·s［6］，由(1)式求得 Stern-Volmer猝滅常數 KSV=0.55 × 1012L/mol·s(R=0.9990)，大于最大動態猝滅常數，表明COS-La配合物對BSA的熒光猝滅效應是二者形成復合物的靜態猝滅。

靜態猝滅作用熒光強度與猝滅劑的關系采用Regression equation方程:

其中，F0為未加入猝滅劑時的熒光強度;F為加入猝滅劑后的熒光強度;K為猝滅劑與BSA分子的結合常數;n為結合位點數。lg(F0/F-1)與nlg［Q］的關系(如圖6b)，滿足線性方程Y=4.80+1.29x(R=0.9976)，所以COS-La與BSA分子的結合常數K=6.35×104L/mol，結合位點數n=1.29。表明COS-La與BSA之間有較強結合作用，可以被蛋白質運輸和儲存。

圖6 COS-La與BSA作用的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern-Volmer plots of the interaction of COS-La and BSA

2.3.2 紫外光譜

動態猝滅只影響熒光分子的激發態，并不改變熒光物質的吸收光譜;在靜態猝滅中，由于猝滅劑與猝滅物質的基態分子發生相互作用，形成基態配合物，從而引起紫外吸收光譜的變化［7］。COS-La對BSA紫外光譜的影響如圖7所示。BSA在280 nm附近吸收峰是其肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的苯雜環π-π*躍遷引起的，在BSA溶液中依次加入COS-La后，吸收強度隨COS-La濃度的增加而增強，說明COS-La能使包圍在BSA分子內部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環疏水基團裸露出來，使吸收強度增強，同時疏水基團之間的疏水作用減弱，π-π*躍遷能量增大，使吸收峰稍有藍移，表明COS-La與BSA混合后生成了一種復合物。紫外光譜結果進一步表明了COS-La與BSA之間的猝滅機制屬于靜態猝滅。

圖7 COS-La對BSA紫外光譜的影響Fig.7 Effect of COS-La on the UV spectra of BSA

圖8 COS-La與BSA體系的循環伏安圖(a COS-La;b COS-La-BSA)Fig.8 Cyclic voltammograms of COS-La-BSA system

2.3.3 電化學

通過循環伏安曲線法考察BSA與COS-La相互作用的電化學行為(見圖8)?？煽闯?，COS-La在-0.6 V附近有一個明顯的峰，當體系中引入BSA后，在電位掃描范圍內未出現新峰，峰電流降低，推測COS-La與BSA作用形成了一種非電活性的超分子化合物，使得COS-La的電化學活性基團隱藏于BSA 內部，導致 COS-La所處環境發生了變化［6，8］。綜合上述分析，進一步表明COS-La對BSA的熒光猝滅不是由于分子間動態碰撞所引起，而是因為形成復合物所產生的靜態猝滅。

3 結論

COS中-NH2上的N原子與仲羥基上的O原子都與La3+發生了配位，COS-La熱穩定性不如COS;COS、COS-La對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較強的抑菌活性，且COS-La的抑菌活性強于COS;COS-La與BSA形成了一種非電活性的超分子化合物，從而猝滅BSA內源熒光，該猝滅機制為靜態猝滅，室溫下配合物與BSA的結合常數和結合位點數分別為6.35×104L/mol和1.29。

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