昆布多糖硫酸酯化修飾及抗腫瘤活性的研究

汲晨鋒 ，孟德友，季宇彬

1國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心哈爾濱商業大學，哈爾濱 150076;2生命科學與環境科學研究中心哈爾濱商業大學，哈爾濱 150076

昆布是海帶科植物海帶Laminaria japonica Aresch.或翅藻科植物黑昆布Ecklonia kurome Okam.的葉狀體。昆布多糖(Laminarin)又稱褐藻淀粉，研究表明其具有抗腫瘤、調節免疫、抑菌、抗病毒、調節血脂、抗氧化、抗凝血、抗輻射、降血糖等作用［1，2］。

多糖是一種承載著巨大構相變量的生物大分子，可以傳遞細胞之間海量的生物信息，在應用研究上，通過化學手段對多糖分子進行改性，使其具有更多的生物活性或者強化已有的生物活性，能夠更廣泛地應用于臨床。對多糖進行硫酸酯化修飾是為了獲取活性高、功能佳的多糖及多糖衍生物，硫酸基的引入會引起多糖理化性質、特別是立體構象的變化，是活性變化的決定因素［3，4］。一些研究表明，有的多糖本來無抗腫瘤活性，經硫酸化后表現出抗腫瘤活性;而有抗腫瘤活性的硫酸多糖被脫去硫酸根后，即失去抗腫瘤活性或活性降低［5，6］。

多糖的硫酸酯化修飾方法主要有濃硫酸法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法、三氧化硫-吡啶法和三氧化硫-二甲基甲酰胺法等，氯磺酸-吡啶法因其產率高及產物回收方便等優點目前被國內廣泛應用［7，8］。本實驗選取昆布多糖為研究對象，采用氯磺酸-吡啶法進行多糖的硫酸酯化修飾，同時考察了多糖修飾前后的結構變化，在此基礎上進一步比較研究了多糖修飾前后抗腫瘤活性的變化，為多糖結構修飾研究及未來的綜合開發利用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

昆布多糖(MW:5000，美國 sigma公司，L9634);氯磺酸、吡啶、二甲基甲酰胺、氯化鋇、硫酸鉀、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、溴化鉀等試劑均為分析純;LOVO細胞(國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱商業大學提供);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);DMEM/F12(1∶1)培養液(HyClone公司);胰蛋白酶(Invitrogen公司);溴化四氮唑藍(MTT，Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO)。

1.2 儀器

W201型數控恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術有限公司);透析袋(截留分子量8000～12000);UV-2102C型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);LD4-2A型低速離AVANCE III 400核磁共振譜儀(Bruker公司);Quanta 250 FEG系列掃描電鏡(FEI公司);離心機(北京醫用離心機廠);3100 FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀(VARIAN公司);Bruker DL-CJ-1N超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司);CO-150 CO2培養箱(美國NBS公司);Model 680酶標儀(美國Bio-rad公司)。

2 實驗方法

2.1 昆布多糖硫酸酯化修飾(氯磺酸-吡啶法)

將100 mg昆布多糖混懸于10 mL二甲基甲酰胺(DMF)中，磁力攪拌器攪拌20 min使其溶解后轉移到裝有酯化試劑(V氯磺酸∶V吡啶 =1∶3)的三頸瓶中。室溫下加完樣后，立即將三頸瓶移入溫度為75℃的水浴中，在攪拌條件下恒溫反應1.5 h。冷卻至室溫后加入50 mL左右冰水，用2.5 mol/L NaOH調至中性，加入三倍體積無水乙醇，4℃冰箱中放置過夜，析出沉淀。離心收集沉淀，并將沉淀溶于適量水，流水透析1 d，蒸餾水透析2 d，濃縮后冷凍干燥2～3 d，得昆布多糖硫酸酯粉末，于干燥箱中保存。

2.2 硫酸基含量測定(鹽酸水解-氯化鋇比濁法)

標準曲線的制備:準確吸取硫酸基標準溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL，用 1 mol/L鹽酸溶液補至0.2 mL，以0.2 mL鹽酸溶液作為空白。加入3%三氯乙酸3.8 mL及氯化鋇-明膠溶液1.0 mL，搖勻，室溫靜置15 min，于360 nm波長處測定吸光度A1;以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇-明膠溶液，測定吸光度A2。其中每點做3個平行樣品，取平均值。以硫酸基濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度(A1-A2)為縱坐標繪制標準曲線。

樣品中硫酸基含量測定:分別吸取樣品溶液各0.2 mL，按標準曲線的方法測定(A1-A2)值，根據標準曲線及換算因子計算硫酸基含量，平行實驗3次，取平均值。

取代度公式:

公式中S為樣品中硫的百分含量，f為換算因子，C為樣品測定值，d為稀釋因子，W為樣品質量。

2.3 紅外光譜分析

稱取昆布多糖純品、LAMS各約1 mg與約200 mg干燥的KBr粉末混勻，置瑪瑙研缽中充分研磨使其混勻，壓片機壓成均勻透明、無明顯顆粒的片。用同法制成只有KBr的供試片作為空白背景，用Varian 3100 FT-IR紅外光譜儀測定樣品4000～400 cm-1的紅外光譜。

2.4 核磁共振分析

稱取昆布多糖純品、LAMS各約5 mg，溶于0.5 mL重水(D2O)中，內標為 TMS，70℃下進行1H NMR分析，再各補加樣品至20 mg溶解于0.5 mL重水(D2O)中，50℃下進行13C NMR分析。

2.5 掃描電鏡觀察

將干燥的昆布多糖、LAMS均勻粘附于帶有導電膠的樣品臺上，置于掃描電鏡的樣品室中抽真空后掃描分析，調節加速電壓為20 kV，放大5000、40000倍，用隨機工作站進行拍攝，觀察表面形態。

2.6 MTT法檢測昆布多糖及其硫酸酯對LOVO細胞生長的影響

將對數生長期的LOVO細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養液稀釋成濃度為1×105個/mL的細胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔培養板中，在37℃、CO2培養箱中培養。培養24 h，每孔加100 μL的藥液，每孔總液體量為200 μL，每個藥物濃度設5個平行孔，昆布多糖的濃度分別為 400、800、1600 μg/mL，陽性藥HCPT的濃度分別為5 μg/mL，空白對照組每孔加 100 μL 的 DMEM/F12(1∶1)培養液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。藥物作用72 h棄上清，每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)，置于37 ℃培養4 h棄上清，每孔加入200 μL的DMSO，在微型振蕩器上振蕩5 min后，用酶標儀在檢測波長570 nm測定吸光度OD570nm值，并計算細胞生長抑制率。

2.7 統計方法

運用SPSS 15.0進行數據統計分析，數據用均數±標準差(ˉ±s)表示，采用One-way ANOVA檢驗各組間差異的顯著性，以P＜0.05時為有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 昆布多糖硫酸酯硫酸基含量測定

硫酸基標準曲線線性回歸方程為Y=2．2856X-0．0205(R2=0.999)含量在12 ～ 120 μg范圍內線性關系良好，測得換算因子f=0.969。經計算，昆布多糖硫酸酯的硫酸基含量為45.92%，取代度為1.51。

3.2 昆布多糖及其硫酸酯紅外光譜分析

昆布多糖紅外光譜如圖1所示，在3370 cm-1處具有O-H伸縮振動的特征吸收峰，由于分子內或分子間氫鍵締合而使吸收峰加寬，說明存在分子內或者分子間氫鍵;2924 cm-1處具有-CH3或-CH2基團的C-H伸縮振動吸收峰;以上兩組吸收峰是糖類物質的特征吸收峰。1641 cm-1處為C=O伸縮振動和非對稱伸縮振動的吸收峰，1371 cm-1處為C-H變角振動的特征吸收峰。1155 cm-1、1076 cm-1和1043 cm-1處為吡喃糖環的醚鍵(C-O-C)和羥基(C-O-H)的特征吸收峰，表明糖環形態為吡喃糖環。889 cm-1處的峰為β-端基差向異構的C-H變角振動的特征吸收峰，表明糖苷鍵為β構型。由以上分析可以初步鑒定昆布多糖是以β-吡喃糖為骨架的多糖，不存在硫酸基(-O-SO3)。其官能團見表1。

圖1 昆布多糖紅外光譜圖Fig.1 IR spectrum of laminarin

昆布多糖硫酸酯的紅外光譜如圖2所示，昆布多糖硫酸酯O-H的伸縮振動產生的糖類物質特征峰比昆布多糖的吸收峰偏移到高波數3441 cm-1，且峰型變窄;2924 cm-1處同樣具有-CH3或-CH2基團的C-H伸縮振動吸收峰。1647 cm-1處為C=O伸縮振動和非對稱伸縮振動的吸收峰。1070 cm-1處為吡喃糖環環內醚C-O伸縮振動吸收峰，表明糖環形態為吡喃糖環。1258 cm-1處出現-OSO3-的S=O拉伸振動特征吸收峰，816 cm-1處出現C-O-S的拉伸振動特征吸收峰，以上兩組吸收峰表明分子內存在硫酸基(-O-SO3)，并且硫酸基連接在糖的C2或C3位。由以上分析可以初步鑒定昆布多糖硫酸酯是以吡喃糖為骨架的多糖，硫酸基(-O-SO3)已與昆布多糖結合成酯，且硫酸基在糖的C2或C3位上取代。其官能團見表1。

圖2 昆布多糖硫酸酯紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of LAMS

表1 昆布多糖及其硫酸酯紅外官能團Table 1 IR analysis of functional groups in laminarin，LAMS

3.3 昆布多糖及其硫酸酯核磁共振分析

3.3.11H NMR分析結果

1H NMR分析結果表明:昆布多糖在δ 4.5～5.5 ppm之間有2個吸收峰，其中1個為D2O溶劑峰，1個為異頭氫信號，化學位移為δ 4.758 ppm，δ小于5.0 ppm，表明昆布多糖的糖苷鍵為β構型。昆布多糖硫酸酯在δ 4.5～5.5 ppm之間有2個吸收峰，其中一個為D2O溶劑峰，1個為異頭氫信號，化學位移為δ 4.965 ppm，δ小于5.0 ppm，表明昆布多糖硫酸酯的糖苷鍵為β構型。

從昆布多糖、昆布多糖硫酸酯的1H NMR圖比較可知，昆布多糖硫酸酯中氫的化學位移相對于昆布多糖的化學位移普遍向低場移動，說明昆布多糖的部分羥基已被硫酸化。

3.3.213C NMR分析結果

昆布多糖硫酸酯的13C NMR分析結果表明:除C4、C5的化學位移基本不變外，其余糖環上的碳化學位移均發生變化(見表2)。昆布多糖硫酸酯與昆布多糖相比，C2、C6信號向低場移動，且峰強度減弱，提示C2、C6位被硫酸基團取代;而C1、C3化學位移向高場移動且C1峰強度減弱，可以推斷是因糖環上硫酸基團的引入對鄰碳位的影響所致。C4、C5化學位移無明顯變化，表明C4、C5位置未被取代，且鄰碳對其無影響。13C NMR分析結果表明，昆布多糖硫酸酯的硫酸基取代位置為C2-OH與C6-OH。

表2 硫酸化后昆布多糖碳上的化學位移變化Table 2 Changes of chemical shifts of laminaria after sulfated modification

3.4 昆布多糖及其硫酸酯掃描電鏡分析

昆布多糖及其硫酸酯粉末的掃描電鏡照片如圖3、4所示，表面立體形態存在顯著差異。昆布多糖呈云霧狀或海綿狀，由多糖顆粒聚集而成;昆布多糖硫酸酯呈片狀或塊狀，單個多糖顆?；緵]有。

3.5 昆布多糖及其硫酸酯對LOVO細胞生長的影響

MTT實驗表明，昆布多糖及其硫酸酯作用于LOVO細胞72 h，可以顯著抑制人結腸癌LOVO細胞的生長，與空白對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。并且隨著藥物濃度的增加，細胞的生長抑制率逐漸升高，呈現藥物濃度依賴性。昆布多糖硫酸酯化修飾后，細胞生長抑制率明顯增加，在相同濃度下，昆布多糖硫酸酯對LOVO細胞的生長抑制作用比昆布多糖作用強，差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表3。

表3 MTT測定昆布多糖、昆布多糖硫酸酯對LOVO細胞生長的影響Table 3 Inhibitory rate of laminarin and LAMS against LOVO cells by MTT assay

4 討論

許多藥理實驗證明一些多糖對腫瘤細胞有直接的細胞毒活性，在體外可直接殺死癌細胞;多數多糖具有體內抗腫瘤作用，不僅能激活T、B淋巴細胞，巨噬細胞(M)，自然殺傷細胞(NK)等免疫細胞，還能活化補體，促進細胞因子的生成，對免疫系統發揮多方面的調節作用［9，10］。

多糖硫酸酯或稱硫酸酯化多糖是多糖大分子鏈中單糖分子鏈上的某個羥基被硫酸根所取代而生成的一類化學結構復雜、生物活性多樣、構效關系鮮明的多糖衍生物，為聚陰離子化合物。多糖硫酸酯可以通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制腫瘤組織血管生成、調節機體免疫功能和提高化療藥物治療腫瘤細胞的增敏作用等，從而達到治療腫瘤的目的。多糖硫酸酯的生物活性與其結構和理化性質緊密相關，多糖硫酸酯化修飾后由于所帶硫酸基團的空間位阻和靜電排斥效應改變了多糖原來的空間結構，增加了糖鏈的屈伸度，提高了水溶性，從而引起生物活性的改變，是多糖結構改造的一個研究熱點［11-13］。

本實驗通過采用氯磺酸-吡啶法合成了取代度為1.5的昆布多糖硫酸酯。紅外光譜顯示，昆布多糖硫酸酯與昆布多糖相比，3400 cm-1左右的-OH的特征吸收峰減弱，810 cm-1左右的對稱C-O-S鍵伸縮振動特征吸收峰與1245 cm-1左右的不對稱S=O伸縮振動特征吸收峰顯現;1H NMR顯示，昆布多糖硫酸酯中氫的化學位移相對于昆布多糖的化學位移普遍向低場移動，說明昆布多糖的部分羥基已被硫酸化。13C NMR顯示昆布多糖硫酸酯的C2與C6信號相對于昆布多糖均向低場移動(3 ppm，6.5 ppm)，且峰強度減弱，C1、C3化學位移向高場移動，C4、C5化學位移無明顯變化，這表明昆布多糖硫酸酯的硫酸基取代位置在C2-OH與C6-OH。并且昆布多糖與其硫酸酯均是以吡喃糖為骨架，β-(1→3)糖苷鍵為主鏈的多糖(C1、C3信號相對于β-D-葡萄糖分別向低場移動5 ppm、7.5 ppm)。掃描電鏡顯示，昆布多糖結構呈云霧狀或海綿狀，而昆布多糖硫酸酯結構呈片狀或塊狀，這可能由于多糖糖單元上的羥基被硫酸基取代后，糖環構象轉變，硫酸基間的排斥作用可能導致構象呈伸展和剛性狀態。

抗腫瘤活性實驗表明，昆布多糖硫酸酯化修飾后抗腫瘤活性明顯增強，同等濃度下昆布多糖硫酸酯對LOVO細胞的生長抑制率均明顯大于昆布多糖。這可能由于多糖經過硫酸酯化修飾后，引起分子結構發生變化，其空間構象也發生變化，生物活性也隨之變化。昆布多糖糖單位的羥基被硫酸基基團取代后，糖環構象發生扭曲或轉變，容易形成非共價鍵;而且這些陰離子基團間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長，部分硫酸基又可能會和糖環上的羥基形成氫鍵，因而在糖鏈局部可能形成了螺旋結構，呈有活性的高級構象，且有序性增大，因此其活性增加。

結構是基礎，活性是目的，對多糖進行硫酸酯化修飾就是為了獲取活性高、功能佳的多糖及多糖衍生物。目前對于引入硫酸根后多糖性狀及構象具體如何變化，從而影響其生物活性，還尚待考察。因而有必要對硫酸酯化修飾進行深入系統的研究，找出一定的規律性，為多糖類藥物的構效關系研究及開發設計提供理論依據。

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