合歡皮中抗腫瘤新生血管高效低毒組分的篩選及藥效學研究

易清清，劉玲艷，馮 磊，邱麗穎

江南大學藥學院，無錫 214122

合歡皮為豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz的干燥樹皮，藥典記載其具有解郁安神、活血消腫的作用，可用于治療心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛［1，2］。相關研究表明合歡皮中含有以下藥理成分，如三萜、生物堿、黃酮、木脂素等，有鎮靜、抗菌、抗生育、抗腫瘤等作用［3］。合歡皮作為我國傳統中藥，其資源豐富，皂苷含量高，結構新穎復雜，抗癌活性顯著［4］。本實驗室前期研究表明，合歡皮水煎液具有抗腫瘤血管新生的活性［5，6］，也對其提取工藝［7］進行了初步研究。為了促使其成藥性，以血管內皮細胞HMEC-1為篩選模型，通過對不同工藝得到的組分的活性和毒性測定，從而篩選出最理想的高效低毒組分，并對其進行初步的藥效學研究。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

合歡皮購自無錫山禾集團中藥飲片有限公司，南京中醫藥大學陳健偉教授鑒定為Albizia julibrissin Durazz的干燥樹皮。MCDB細胞培養基(Sigma公司，美國)，小牛血清(上海冠羽生物科技有限公司)，Multiskan MK3自動酶標儀(Labsystem公司，美國)，DMEM細胞培養基(GIBCO公司，美國)，胎牛血清(上海洛神生物技術有限公司)，青霉素(華北制藥股份有限公司)，鏈霉素(大連美羅大藥廠)，Matrigel matrix(BD公司，美國)。

1.2 細胞株

SV40病毒轉染的人微血管內皮細胞(HMEC)傳代株由法國國家衛生醫學研究院U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈，保存于液氮罐中;SV40病毒轉染的小鼠淋巴瘤內皮細胞傳代株(3B11)由美國Scripp研究所周泉生教授饋贈，保存于液氮罐中;H22肝癌瘤株來源于上海醫藥工業研究院藥理學研究室。

1.3 實驗動物

ICR健康雄性小鼠(上海斯萊克試驗動物有限責任公司，SCXK(浙)20080033)80只，鼠齡4～5周，體質量(25±2)g。飼養溫度25℃，相對濕度55%。

2 方法步驟

2.1 提取分離組分1～24

2.1.1 原料藥制備:稱取100 g合歡皮，加入1 L去離子水，煮沸后文火煮1.5 h，共兩次，過濾，合并兩次水煮液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到原料藥。

2.1.2 按極性萃取:取凍干粉500 mg，溶于100 ml去離子水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取3次，得到各有機相標記為組分1，2，3和4，水相為5。

2.1.3 按目標產物萃取:將兩次原料藥水煮液濃縮至300 ml，加無水乙醇至終濃度95%，4℃靜置24 h后過濾，上清液旋轉蒸發濃縮，水復溶后冷凍干燥得凍干粉。路線1:取凍干粉1 g，100 ml純水溶解，滴加10%NaOH至PH=9～10，氯仿萃取3次，水相中滴加2%HCL至PH=7，水飽和正丁醇萃取3次，收集有機相和水相(標記為組分6，7，8)。路線2:取凍干粉1 g，100 ml純水溶解，滴加2%HCL至PH=3～4，氯仿萃取3次，水相中滴加10%NaOH至PH=7，水飽和正丁醇萃取3次，收集有機相和水相(標記為組分9，10，11)。路線3:取凍干粉 1 g，100 mL純水溶解，水飽和正丁醇萃取3次，收集有機相和水相(標記為組分12，13)。

2.1.4 大孔樹脂法分離:醇溶凍干粉50 mg溶于25 mL超純水中，藥液上柱預吸附2 h，依次用水，30%、50%、70%乙醇梯度洗脫，每個濃度洗3倍柱體積，流速1.5 mL·min-1，收集水洗脫組分及30%、50%、70%乙醇洗脫組分(標記為組分14，15，16，17)，旋轉蒸發后冷凍干燥。

2.1.5 簡化工藝分離:取原料藥凍干粉1 g，100 mL水溶解，先用石油醚等體積萃取3次，再用正丁醇萃取5次，收集有機相和水相(標記為組分18，19，20)。醇溶凍干粉水溶液用水飽和正丁醇等體積萃取5次，收集有機相和水相(標記為21，22)。稱取100 g合歡皮，加入1 L 70%乙醇，回流2次，每次2～2.5 h，水煮液過濾，旋轉蒸發至干，去離子水復溶，凍干，取凍干粉1 g，100 mL水溶解，水飽和正丁醇萃取3次，收集正丁醇相和水相(標記為23，24)。

2.2 細胞培養

HMEC-1細胞用含1 mmol/L谷氨酰胺、10 μg·L-1EGF和100 ml·L-1小牛血清的MCDB-131培養液，于37 ℃、50 ml/L CO2培養箱中傳代培養。

3B11用含1 mmol/L谷氨酰胺、100 U/L雙抗和100 ml/L胎牛血清的DMEM培養液，于37 ℃，50 ml/L CO2培養箱中傳代培養［8］。

2.3 SRB實驗

取對數生長期HMEC-1細胞，每孔8000個細胞接種于96孔板中，放置于37℃、50 mL/L CO2的培養箱中培養24 h，加入不同濃度的組分1～24作用48 h，以不加藥組為陰性對照組，加藥后培養至72 h測板，用MK3型酶標儀在波長A540處測定每孔A值。

取對數生長期3B11細胞，每孔4000～5000個細胞接種于96孔板中，放置于37℃、50 ml·L-1CO2的培養箱中培養24 h，加入不同濃度的組分23作用48 h，以不加藥組為陰性對照組，加藥后培養至72 h測板，用MK3型酶標儀在波長A540處測定每孔A值。

2.4 細胞毒評價

嚴格按照LDH測定試劑盒，根據標準曲線，確定取樣量20 μL，對每個有活性組分進行測定，以出現活性增加的最小有效濃度作為評價毒性的濃度。

2.5 組分化學定性［9］

采用典型的化學定性方法:碘一碘化鉀試劑，磷鉬酸試劑來檢測有無生物堿，泡沫試驗，乙酸酐—濃硫酸反應檢測有無皂苷，鹽酸-鎂粉反應，堿液試驗檢查黃酮類化合物。

2.6 細胞遷移實驗

用劃線灼傷法研究細胞遷移，在100×顯微鏡下拍同一視野處0 h和48 h細胞遷移圖，所得圖片用IPWin60C軟件圖象軟件進行處理，測量灼傷帶距離，計算遷移率(100%)，所得數據進行統計處理，結果用±s表示。

2.7 細胞成管實驗

實驗前12 h將Matrigel置于4℃下融化，實驗時將24孔板放置冰上，Matrigel按150 μL/孔鋪板，37℃，50 Ml/L CO2及飽和濕度的培養箱中孵育30 min。然后將組分23按不同濃度與細胞懸液等體積混勻，并設置對照組，37℃、50 mL/LCO2及飽和濕度的培養箱中孵育12 h，每隔一段時間進行拍照。

2.8 急性毒性測定

最小致毒量觀察:組分23以50，75，100 mg·kg-1的劑量分組給藥，每個劑量間隔5～7 d，每個劑量5只ICR小鼠，同時設生理鹽水對照組。觀察體重、飲食、飲水等指標，與對照組比較，其中有指標出現異常，此劑量即定為最小致毒量。

最小致死量觀察:組分23以1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000 mg·kg-1的劑量分組給藥，每個劑量間隔5～7 d，每個劑量5只ICR小鼠，同時設生理鹽水對照組。以5只小鼠出現1只死亡為準，此劑量即定為近似致死量。

2.9 腫瘤小鼠模型的建立

取小鼠H22肝癌細胞腹腔內接種7 d的小鼠，無菌條件下抽取腹水，用0.9%生理鹽水稀釋4倍(細胞懸液置于冰上)，用1 mL無菌注射器分別于每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL，整個過程在半小時內完成。動物造模右腋下接種作為實體瘤小鼠。

分組:正常鼠10只，接種后的實體瘤小鼠隨機分為模型對照組、組分23給藥低、中、高3個劑量組，每組10只。于24 h后灌胃給藥。給藥劑量為:低劑量組2 mg·(kg·d)-1，中劑量組4 mg·(kg·d)-1，高劑量組 8 mg·(kg·d)-1，持續給藥 14 d，每天1次。正常組與模型對照組給予生理鹽水。

3 結果與討論

3.1 各組分細胞活性檢測結果

前期實驗測定原料藥對內皮細胞達到半數抑制率時的濃度 30 μg·mL-1［5］，所以本實驗設置三個濃度(3、30、60 μg·mL-1)對其活性進行評價。其中，給藥濃度為30 μg·mL-1時抑制率超過50%的有組分 4(71.90% ±2.45%)、7(79.56% ±3.18%)、10(72.84% ± 2.24%)、12(84.55% ±1.20%)、16(63.76% ± 3.18%)、17(86.83% ±1.57%)、19(63.41% ± 0.92%)、21(84.55% ±1.20%)、23(65.81% ±1.71%)，視為有活性組分。

3.2 高效低毒組分篩選結果

根據3.1的活性篩選結果，進一步計算活性組分達到半數抑制率(IC50)時的濃度，通過表1中IC50和致LDH陽性反應的濃度，得到3個較為理想的組分，分別為組分19、21、23，其中最理想的組分為23。

表1 活性組分對HMEC-1細胞的IC50和致LDH陽性反應的濃度(n=5，±s)Table 1 the IC50and the concentration iducing LDH positive response of active component in the HMEC-1 cells(n=5，±s)

表1 活性組分對HMEC-1細胞的IC50和致LDH陽性反應的濃度(n=5，±s)Table 1 the IC50and the concentration iducing LDH positive response of active component in the HMEC-1 cells(n=5，±s)

組分Components 47 10 12 16 17 19 21 23 IC50μg·mL-1 7.82±0.767.91±0.338.25±1.156.96±0.1924.19±1.645.40±0.588.12±0.766.96±0.19 4.18±0.37致LDH陽性反應濃度μg·mL-120 20 20 30 20 20 20 30 40

3.3 組分定性結果

從表2可以看出，3個有效組分的皂苷檢測實驗均呈陽性，主要成分為皂苷。

表2 定性實驗結果Table 2 The results of qualitative tests

3.4 組分23對HMEC-1細胞遷移能力的影響

通過比較對照組和給藥組灼傷距離來判斷遷移能力。與對照組相比，10 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的組分23均能明顯抑制HMEC-1細胞，對照組的遷移率為84.37±1.30%，組分23兩個濃度的遷移率分別為65.01±4.58%、47.88±8.16%，表明組分23對HMEC-1細胞的遷移具有顯著的抑制作用(P＜0.01)。

圖1 不同濃度組分23對HMEC-1細胞遷移的影響Fig.1 Effects of different concentrations of component 23 on HMEC-1 cell migration

3.5 組分23對HMEC-1細胞成管能力的影響

從圖2可以看出，對照組細胞成管狀態良好，管腔清晰可見，而給藥后與對照組相比成管面積明顯減少，表明組分23具有顯著抑制內皮細胞成管的作用。

圖2 不同濃度組分23對HMEC-1細胞成管的影響Fig.2 Effects of different concentrations of component 23 on tube formation of HMEC cells

3.6 組分23在3B11細胞上的評價

3.6.1 組分23對3B11細胞的IC50

組分23在3B11細胞上的IC50為7.78±0.96 μg·mL-1，表明3B11細胞對組分23的敏感性低于HMEC-1細胞(P＜0.05)。

3.6.2 組分23對3B11細胞遷移能力的影響

圖 3 中 20 μg·mL-1和 40 μg·mL-1的組分 23均能明顯抑制3B11細胞的遷移，對照組的遷移率為90.18±1.74%，組分23兩個濃度的遷移率分別為50.12±5.43%、35.32±5.46%，表明組分23對3B11細胞的遷移具有顯著的抑制作用(P＜0.01)。

圖3 不同濃度組分23對3B11細胞遷移的影響Fig.3 Effects of different concentrations of component 23 on 3B11 cell migration

3.6.3 組分23對3B11細胞成管的影響

從圖4可以看出，給藥后很多管腔出現斷裂，成管面積顯著減少，表明組分23具有顯著抑制3B11細胞成管的作用。

圖4 不同濃度組分23對3B11細胞成管的影響Fig.4 Effects of different concentrations of component 23 on tube formation of 3B11 cells

3.7 組分23最小致死量和最小致毒量結果

組分23的最小致毒量為100 mg·kg-1，最小致死量為4000 mg·kg-1，說明最大耐受量和最小致毒劑量之間跨度范圍比較大，臨床使用安全性比較高。

3.8 組分23對H22荷瘤小鼠瘤重的影響

各組H22小鼠腫瘤如圖5、表3所示，與對照組比較，高、中劑量組抑瘤率＞30%，低劑量組抑瘤率＜30%，其中高劑量組抑瘤率最高。

圖5 各組H22小鼠腫瘤大小Fig.5 The tumor size in each group of H22 mice

表3 各組H22小鼠瘤重及抑瘤率Table 3 The tumor weight and tumor inhibiting rate of H22 mice in each group

3.9 組分23對H22荷鼠腫瘤新生血管的影響

通過免疫組化染色，細胞凋亡檢測，顯微鏡下計數10個視野取平均值，結果如表4，由表可見，與模型對照組相比，中高劑量組CD31蛋白標志腫瘤血管數明顯降低，低、中、高劑量組腫瘤細胞凋亡數目均增高。

表4 各組指標的比較Table 4 Comparison of the various groups of indicators

3.10 討論

腫瘤的生長分為2個明顯的階段:無血管期和血管期，在無血管期實體腫瘤的生長主要靠滲透獲得營養，直徑不會超過2 mm，并且沒有轉移能力，一旦進入血管期，血管的生成就使腫瘤獲得足夠的血供和營養，而且由于新生血管的基底膜不完整，血管通透性高，腫瘤細胞極易穿透血管壁而發生轉移［10］。因此，抑制腫瘤血管生成是治療腫瘤的一種重要方法。血管內皮細胞在血管發生中具有重要作用，通過抑制它的增殖可以抑制腫瘤血管生成，進而抑制腫瘤的惡性生長和轉移［11，12］。所以，利用血管生成抑制劑可以特異性地抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖和活性，抑制腫瘤的生長和轉移而不影響其他正常細胞［13］。目前國外藥物研究發現阿瓦斯汀，血管生成抑制素和內皮抑素有明顯的抗腫瘤血管生成作用，但是這3種都屬于多肽類藥物，穩定性較差，不能口服給藥，而且用藥劑量較大，治療時間長，這些都直接或間接地增加了患者的負擔。所以我們有必要發揮中國自己的優勢，從天然產物、中藥材中篩選到用藥劑量小、可以口服給藥、藥效等于或優于以上3種抗腫瘤新生血管的藥物。

本研究室多年來一直從事從天然產物、中藥材中篩選出用藥劑量小、可以口服給藥、藥效較好的抗腫瘤新生血管藥物。前期已從合歡皮中分離得到了合歡皮總皂苷提取物，并對其進一步分離純化得到了合歡皮抑制腫瘤血管生成的單體化合物，J8和J12。經體內、外藥效學、藥理學、毒理學實驗表明，已提取的有效組分和單體可有效抑制內皮細胞增殖，抑制腫瘤生長，目前本研究室已經為該研究申報專利，擁有獨立的知識產權［14，15］。前期工作雖然已經提取到有效的抗腫瘤新生血管的組分和單體，但是毒性大安全范圍較小。所以本研究以提取分離高效低毒的有效組分為目標，通過按極性萃取原料藥、按目標產物萃取原料藥、大孔樹脂法分離原料藥、簡化工藝分離原料藥共獲得24個組分，然后以HMEC-1細胞為篩選模型，從組分1～24中篩選出高效低毒組分23，化學成分定性主要為皂苷，并初步探索組分23的體內外藥效、毒理學相關指標，為申報中藥第五類新藥提供材料。此外，本文沒有研究活性組分23在體內作用的相關靶蛋白及其作用機制，有待進一步研究。

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