雷帕霉素對野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓及肺血管重構的影響

劉 杰 杜雨軒 王 望 國 桓 王 軍* 王 辰

(1.首都醫科大學基礎醫學院生理學教研室，北京100069;2.北京市呼吸和肺循環疾病重點實驗室，北京100020;3.衛生部北京醫院，北京100730)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是由不同病因所導致的，以肺動脈壓力和肺血管阻力進行性升高為特點的，以肺血管重構為主要病理特征的一組綜合征［1］。目前針對肺動脈高壓的治療以舒張血管為主，從而起到緩解癥狀，改善運動耐量的作用，但這些藥物并不能從根本上有效的抑制或者逆轉肺血管重構［2］，進而阻止肺動脈高壓的發生與發展。

雷帕霉素(rapamycin)是一種具有抗腫瘤細胞增生、抗免疫作用的大環內酯類抗生素［3］。它通過與細胞內的FK506結合蛋白12(FK506-binding protein 12，FKBP12)結合并形成復合物后，進而與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)相互作用，抑制DNA和蛋白質的合成，導致G1期細胞周期阻滯，從而抑制細胞的增生［4-5］。

因此，本文的目的在于探討雷帕霉素是否可以通過抑制肺血管壁細胞異常增生從而干預肺動脈高壓的發生與發展，進而為肺動脈高壓的預防和治療提供新的靶點與思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1)實驗動物及分組:雄性健康成年SD大鼠28只，購自首都醫科大學〔實驗動物許可證號:SCXK(京)2006-0009〕，體質量300 g左右，采用抽簽法將動物隨機分為3組(對照組、野百合堿組和雷帕霉素干預組)，每組又分為3個時間點，即0周(n=4，由于0周時各組尚未做任何處理，因此3組共用一組實驗動物)，2周(n=4/組)和4周(n=4/組)。① 對照組(control組)(n=4:實驗開始第1天腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1次;②野百合堿組(monocrotaline組，MCT組)(n=12):實驗開始第1天腹腔注射MCT(60 mg/kg)1次;③雷帕霉素干預組(rapamycin組)(n=12):于MCT腹腔注射前1 d給予rapamycin(2 mg/kg)腹腔注射，隨后隔天注射，3 次/周。

2)主要試劑配制及系統:MCT購自美國Sigma公司(將MCT溶于1 mol/L HCl后，用1 mol/L NaOH調整pH為7.4，用0.9%氯化鈉注射液調整其終濃度為10 g/L)，雷帕霉素購自華北制藥集團(用無水乙醇將雷帕霉素配制成濃度為30 g/L的儲液，用含0.25%聚乙二醇400(PEG-400)和0.25%吐溫20(Tween-20)的溶液將儲液稀釋為0.6 g/L的工作液)。PEG-400購于北京化學試劑公司，Tween-20購于鼎國昌盛生物技術有限責任公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1)右心室收縮壓及右心室肥厚指數的檢測:分別在實驗的0、2、4周將各實驗組動物用2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，并用250 U的肝素抗凝后，行右心導管插入術檢測右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)。分離出大鼠心臟，剪掉心耳，沿室間隔剪下右心室，分別稱量右心室(right ventricle，RV)、左心室+室間隔(left ventricle plus interventricular septum，LV+S)的質量，計算 RV/(LV+S)×100%，即右心室肥厚指數(the index of right ventricular hypertrophy，RVHI)。

2)肺組織病理切片:將各實驗組動物的肺組織固定于4%中性甲醛，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，做4 μm/張的連續切片，進行HE染色。應用Image-Pro Plus 5.1病理圖像分析系統測定各實驗組動物肺小動脈管壁的血管外周長(中膜以內)和血管腔周長(內膜表面以內)。依據公式:①中膜厚度=血管外周長/2π－血管腔周長/2π;② 血管壁中層橫截面積=血管外周長2/4π－血管腔周長2/4π;③血管壁中層厚度占外徑百分比(media thickness%，MT%)=(中膜厚度×2)/(血管外周長/π)×100%;④血管壁中層橫截面積占血管總橫截面積百分比(media cross-sectional area%，MA%)=血管壁中層橫截面積/(血管外周長2/4π)×100%。本實驗主要研究外徑在150 μm以下的肺細小動脈，每只大鼠檢測5～10根血管，每組檢測3只大鼠。

1.3 統計學方法

使用SPSS 11.0軟件對數據進行統計分析。計量數據以均數±標準誤(ˉx±SE)表示，采用3×3析因方差分析，組間均數比較采用LSD。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況及體質量變化

對照組大鼠毛發光亮，體質量隨時間增加。MCT組大鼠毛發灰暗，活動度降低，體質量明顯減輕，胸腔積液，肝臟淤血，肺臟瘀斑，心臟增大。雷帕霉素干預組體質量顯著降低，未見其他異常。與對照組相比，野百合堿組大鼠2周時體質量即出現明顯降低〔(369.75 ±2.14)g vs(393.55 ±10.09)g，P ＜0.05〕，4 周時降低更加顯著〔(377.78 ±15.49)g vs(452.33±9.52)g，P ＜0.01〕。雷帕霉素干預組與野百合堿組相比，體質量進一步降低，2周時為〔(282.70±6.61)g vs(369.75 ±2.14)g，P ＜0.01〕，4 周時為〔(311.20±3.80)g vs(377.78 ±15.49)g，P ＜0.01〕(圖 1)。

圖1 各組大鼠體質量Fig.1 Comparison of body weight among the groups

2.2 大鼠RVSP的改變及雷帕霉素的干預作用

對照組大鼠的RVSP在實驗期間無明顯變化。但野百合堿組大鼠自2周起RVSP即明顯高出對照組(47.62 ±15.04)%，至4 周時已經高達(45.40 ±3.53)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。雷帕霉素干預組大鼠的RVSP盡管在各時點仍高于對照組，但與MCT組比較已明顯降低。在2周和4周時分別降低(17.04±3.52)%和(20.88 ±5.00)%。如表1 所示，雷帕霉素干預顯著地抑制了野百合堿誘導的大鼠RVSP的升高。

表1 各組大鼠右心室收縮壓Tab.1 Comparison of RVSP among the three groups(ˉx±SE，mm Hg)

2.3 大鼠RVHI的改變及雷帕霉素的干預作用

對照組大鼠的RVHI在各時點差異無統計學意思。但MCT組大鼠自2周起RVHI即顯著地高出對照組(16.69±2.48)%，4周時 RVHI繼續增加達(55.96±1.96)%。雷帕霉素干預組大鼠盡管在4周時的RVHI仍高于對照組，但與野百合堿組相比，RVHI顯著降低。2周時雷帕霉素干預組大鼠RVHI較野百合堿組降低(13.70±4.72)%，4周時降低(36.69±2.62)%。雷帕霉素顯著地抑制了野百合堿誘導的大鼠RVHI的增加，詳見表2。

表2 各組大鼠右心室肥厚指數Tab.2 Comparison of RVHI among the three groups(ˉx±SE，%)

2.4 大鼠肺血管重構及雷帕霉素的干預作用

對照組大鼠肺腺泡內肺動脈管壁較薄，管腔正常。與對照組相比，野百合堿組大鼠肺腺泡內肺動脈管壁增厚程度顯著增加，管腔狹窄，并且隨著時間的延長，病理變化更加明顯。雷帕霉素干預組大鼠腺泡內肺動脈結構清晰，形態基本正常(圖2)。因肺動脈高壓血管壁重構主要發生在血管中層，因此本研究用血管壁中層厚度占外徑百分比(MT%)，血管壁中層橫截面積占血管總橫截面積百分比(MA%)作為衡量肺血管重構的指標。與對照組相比，野百合堿組大鼠MT%、MA%都增加(P均＜0.01)。與野百合堿組相比，雷帕霉素干預組大鼠MT%、MA%都降低(P均＜0.01)。如表3所示，雷帕霉素干預顯著地抑制了野百合堿誘導的大鼠肺血管的重構。

3 討論

本研究采用一次性腹腔注射野百合堿的方式，成功地復制出肺動脈高壓大鼠模型。與對照組相比，野百合堿組大鼠肺動脈壓力、右心室肥厚程度顯著增加，肺小動脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄。與野百合堿組相比，雷帕霉素干預組大鼠肺動脈壓力、右心室肥厚程度顯著降低，肺小動脈血管壁未見明顯增厚。雷帕霉素的早期使用有效干預了野百合堿所誘導的大鼠肺動脈高壓及肺血管重構的形成。

肺動脈高壓是一種以肺血管收縮、血管壁重構以及原位血栓形成為病理特點的，許多相關因子參與［6］的以肺血管壁各層細胞增生為顯著特征的致命性疾病。根據肺動脈高壓的病理機制，臨床上針對肺動脈高壓的治療藥物主要通過3種途徑發揮作用:內皮素途徑、一氧化氮途徑以及前列環素途徑。然而其5年生存率仍僅為50%［7］。另外，由于受到藥物自身藥代動力學的影響，這些藥物的使用范圍受到了廣泛的限制［8］。因此，探索一種方便、安全、長效的抑制血管壁細胞增生的藥物成為當今治療肺動脈高壓的重點與熱點。

圖2 各組大鼠肺組織HE染色Fig.2 Sections of the lungs were stained with HE

表3 各組大鼠MT%、MA%Tab.3 Comparison of MT%，MA%of small pulmonary arteries among the groups(ˉx±SE，n=15～30)

在心血管系統中，雷帕霉素能夠有效的抑制生長因子刺激的血管內皮細胞、平滑肌細胞［9］以及成纖維細胞［10］的增生，因此雷帕霉素藥物洗脫支架安全有效的防止了冠狀動脈支架放置術后新生內膜形成引起的再狹窄［11］。雷帕霉素亦能有效的抑制生長因子等誘導的mTOR/p70S6K信號通路的活化，從而抑制肺血管壁細胞的生長與增生［12-14］。同時，雷帕霉素也可能通過抑制庫容性鈣離子內流(store operated Ca2+entry，SOCE)，降低細胞內的Ca2+濃度，從而有效的抑制慢性血栓栓塞性肺動脈高壓患者平滑肌細胞的增生［12］。雷帕霉素還可通過上調肺動脈內皮細胞以及平滑肌細胞內的血紅素加氧酶，來抑制肺動脈內皮細胞以及平滑肌細胞的增生［15］。另外，雷帕霉素可通過上調KLF4/p27的蛋白表達［16］，抑制平滑肌細胞的增生?？梢?，雷帕霉素可以通過調節不同的信號通路，抑制血管壁各層細胞，尤其是血管壁平滑肌細胞的增生，但其確切的作用機制，目前尚不清楚。

本研究尚存在許多不足，首先是只使用了單一劑量的雷帕霉素，并沒有檢測不同劑量的雷帕霉素對于野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠的影響。本研究中，雷帕霉素干預組大鼠的體質量明顯低于對照組以及野百合堿組，這可能與藥物的使用劑量有關。其次，本實驗也沒有研究雷帕霉素對于野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠的逆轉作用。再次，關于雷帕霉素發揮保護作用的機制還有待于進一步深入的研究。

總之，本研究通過在體實驗證實雷帕霉素可有效干預野百合堿所誘導的肺動脈高壓大鼠的血流動力學、右心室肥厚程度以及肺血管重構情況。雷帕霉素有可能通過抑制肺動脈平滑肌細胞的增生，從而干預了肺血管壁的重構以及肺動脈高壓的形成，從而為臨床上預防和治療肺動脈高壓提供了新的靶點與思路。

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