流式細胞術分析小鼠肝纖維化時機體免疫細胞的變化

劉 新 婁金麗* 白 麗 張曉慧 丁 美 段鐘平

(1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院臨檢中心，北京100069;2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院人工肝中心，北京100069)

肝纖維化是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)等各種病因引起的慢性肝損傷發展為肝硬化的必經病理過程，阻斷或者逆轉肝纖維化是治療慢性肝病的重要目標［1］。就HBV感染而言，世界上每年約有3.5億人感染HBV，其中100多萬人死于肝病末期［2］，因此研究免疫因素對纖維化的調節作用，對控制纖維化的進展、控制慢性肝損傷的病死率有重要意義。流式細胞術(flow cytometry，FCM)分析四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導的肝纖維化小鼠的外周血和肝組織浸潤的Tregs、NK1.1+細胞、CD4+細胞和 CD8+細胞頻率的變化，以闡述肝臟局部浸潤肝纖維化時不同免疫細胞的變化，初步探討Tregs等免疫細胞在纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組與肝纖維化模型的建立

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6J雄性小鼠，體質量(20±2)g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院提供〔實驗動物許可證號:SCXK-(軍)2007-004〕。采用數字表法隨機分成2組，分別為對照組和肝纖維化組，每組5只。肝纖維化組腹腔注射CCl4(濃度從2% 逐漸增加至30% ，0.1 mL/10 g，2次/周，6周)，對照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2 血清轉氨酶檢測

眼球采血分離血清，生化法檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)。

1.3 病理學觀察

用10%中性甲醛固定肝組織，包埋、切片、行 HE染色及Masson染色，顯微鏡下觀察肝組織炎性反應及纖維化程度。

1.4 肝組織非實質細胞的分離

常規取小鼠肝臟，研磨肝組織后，加IV型膠原酶(終濃度0.5 mg/mL，美國 Sigma 公司)、DNaseⅠ (終濃度50～100 U/mL，美國Sigma公司)，放震蕩孵箱(37℃，40 min)進行消化、離心細胞并進行沖洗。用Ficoll液分離，取霧狀白膜層細胞，洗后計數細胞稀釋至106/mL以備染色，進行流式檢測。

1.5 流式細胞儀檢測

小鼠外周血細胞Foxp3抗體胞內染色需固定破膜，按試劑說明書操作程序進行染色。肝的非實質細胞提取后，鏡下計數調整至合適的濃度，取大約105個細胞進行染色，不需要裂解紅細胞，方案與血液的染色方案基本相同。所用流式細胞儀FC500(Beckman Coulter)，所用抗體Anti-mouse CD4 FITC(clone:GK1.5)、Anti-mouse CD8a PE-Cy7(clone:53-6.7)、Antimouse CD25 FE-Cy5(clone:PC61.5)、Anti-mouse Foxp3 PE(clone:NRRF-30)、Rat IgG2a K Isotype Control PE、NK1.1 PE及固定破膜劑均來自于eBioscience公司。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件，計量數據以均數±標準差(ˉ±s)表示，Levene’s分析組間方差齊性，符合方差齊性的采用獨立樣本t檢驗，方差不齊采用校正t檢驗;肝臟和血液中的差異分析采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCl4誘導的小鼠肝纖維化的建立

1)肝功能的改變

肝纖維化組小鼠血清ALT〔(567.33 ±242.53)U/L〕高于對照組〔(41.63 ±18.40)U/L，P ＜0.05，n=3〕。

2)肝組織病理學改變

肝臟大體觀，肝纖維化組小鼠肝組織觸之較對照鼠肝臟稍硬，表面和切面呈彌漫小結節，有細顆粒感。HE染色顯示纖維化組肝細胞索排列紊亂，肝小葉結構破壞或消失，纖維隔內有大量炎性細胞及成纖維細胞浸潤。Masson染色鏡下觀察，纖維化組肝組織匯管區、中央靜脈可見大量膠原，肝小葉被大量膠原纖維束分割并包繞，形成纖維間隔(圖1)，提示肝纖維化成功建立。

2.2 纖維化小鼠調節性T細胞上升

與對照組小鼠比較，可以看到纖維化時肝中浸潤的調節性T細胞 CD25+Foxp3+/CD4+增加(P＜0.01，表1、圖2)，與此同時，纖維化肝組織CD4+細胞中CD25+細胞的表達頻率以及CD25+細胞中Foxp3+細胞的表達頻率均上升(P＜0.05)。在外周血中，檢測結果與肝組織的檢測結果趨勢相同，但與對照組比較，差異無統計學意義(表1)。

2.3 纖維化時肝內NK1.1+細胞下降

NK1.1+細胞在對照組肝臟中的表達為(19.80±5.97)%遠遠高于其在血液中的表達(1.06±0.63)%(P ＜0.01，n=5)，肝纖維化小鼠肝組織中 NK1.1+細胞占淋巴細胞的百分比為(9.53±2.25)%，顯著低于對照組(P＜0.05，n=5)，肝纖維化小鼠血液中NK1.1+細胞占淋巴細胞的百分比為(0.38±0.13)%，低于對照組的表達(P ＜0.05，n=5)，詳見圖3。

2.4 肝纖維化時CD4+細胞、CD4+/CD8+比值下降

肝纖維化時機體處于免疫耐受的狀態，結果均顯示肝纖維化組肝組織中CD4+細胞的比例下降，CD4+/CD8+比值下降，但差異無統計學意義(P＞0.05)，血液中亦如此，詳見表2。

圖1 實驗小鼠6周時肝組織病理學改變Fig.1 Pathological changes of liver of C57BL/6J mice in the sixth weeks(100×)Black arrow:collagenous fiber bundle.

表1 肝臟內和外周血中調節性T細胞的變化Tab.1 Changes of Tregs frequency in liver and peripheral blood n=3(%)

3 討論

目前采用流式細胞術對肝纖維化的研究主要集中于對血液細胞的分析，也有對脾臟中細胞變化進行研究的。但是這些細胞都不能很好的說明肝臟局部免疫細胞的變化，因此本研究建立了肝非實質細胞的流式細胞術檢測方法，分析肝臟局部的免疫應答狀態。

Kvakan等［3］研究證實Tregs細胞對心臟纖維化過程具有抑制作用，Claassen等［4］研究發現Tregs對HCV感染導致的肝纖維化可能具有抑制作用?；赥regs細胞在器官纖維化中的作用，本研究進一步研究其與小鼠肝纖維化的相關性。結果顯示，肝纖維化時，肝臟中浸潤的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例上升，提示調節性T細胞參與了CCl4介導的小鼠肝纖維化過程中的免疫調節，也就意味著纖維化時肝組織局部處于免疫耐受狀態，筆者在肝纖維化Balb/c小鼠的肝組織中也發現了相同的情況，并且這種上升不僅表現為CD25+Foxp3+/CD4+的升高，而且CD25+細胞中Foxp3+的表達也升高;血中Tregs占淋巴細胞的比例也有輕微的上升，但差異無統計學意義。因此筆者推測肝局部浸潤Tregs可能對肝纖維化起到一定的抑制作用。

圖2 肝纖維化組肝臟內浸潤的Tregs上升Fig.2 The intrahepatic infiltrating Tregs increased in fibrosis group

圖3 外周血和肝臟內浸潤的NK1.1+細胞的比較Fig.3 Comparisons of NK1.1+cells in peripheral blood and liver

結果還顯示纖維化小鼠肝組織和血中的Tregs上升的同時，CD4+、CD4+/CD8+細胞呈現下降的趨勢，差異無統計學意義，可能是由于例數過少。先前很多的文獻［4］報道CD4+CD25+調節性 T細胞可以抑制CD4+、CD8+細胞的活化和增生，并且這種抑制作用是非特異的，因此推測肝纖維化時 CD4+、CD4+/CD8+T細胞比值的下降可能是由Tregs介導的。

目前已證實NK1.1是小鼠自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)、NKT細胞特異性分子標志，本研究的流式結果顯示NK1.1+細胞在小鼠肝組織中的表達顯著高于其在血液中的表達。據文獻［4，6］報道，與其他器官相比較，小鼠肝內的NKT細胞比例是最高的。筆者還發現肝纖維化時，伴隨肝組織Tregs升高的同時，NK1.1+細胞下降。Hong 等［7］認為體外 Tregs可以直接抑制NKT細胞的功能，消除小鼠體內的Tregs可以增強NKT細胞的抗腫瘤活性;另外，Tregs對NK細胞具有抑制作用［8］，其抑制作用包括降低NK細胞的細胞毒作用和下調NK細胞分泌IFN-γ的能力［9］。

表2 肝臟中和外周血中CD4+細胞與CD4+/CD8+比值的比較Tab.2 Comparisons of CD4+cells and ratios of CD4+cells to CD8+cells in peripheral blood and liver %

綜上所述，本研究認為肝纖維化時機體處于免疫耐受狀態，表現為Tregs的升高，且肝臟局部的升高更明顯，NK1.1+細胞、CD4+細胞比例下降，并且這些細胞的下降可能受Tregs的調節。

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［4］Claassen M A，de Knegt R J，Tilanus H W，et al.Abundant number of regulatory T cells localize to the liver of chronic hepatitis C infected patients and limit the extent of fibrosis［J］.J Hepatol，2010，52(3):315-321.

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