新疆維吾爾族不同性別人群中MK2基因變異與低密度脂蛋白膽固醇水平及腫瘤壞死因子-α的相關性

林 娜，李南方，姚曉光，王紅梅，梁登攀，郭艷英，周 玲

新疆維吾爾自治區人民醫院高血壓中心 新疆高血壓研究所，烏魯木齊830001

血脂異常是心血管病發病重要獨立危險因素和基本病理基礎，各種血脂成分異常與心腦血管疾病關系受到人們越來越多的關注，血漿膽固醇特別是低密度脂蛋白膽固醇 (low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)升高，是動脈粥樣硬化發生和發展的必備條件，是最重要的致病性危險因素。研究顯示，炎癥反應在動脈粥樣硬化發生發展中有著十分重要的作用［1-2］。絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)是生物體內重要的信號轉導系統之一，能被多種炎性刺激所激活，并對炎癥的發生、發展起重要調控作用。p38是控制炎癥反應最主要的MAPK家族成員之一，MAPK激活的蛋白激酶2(mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2，MAPKAPK2或MK2)是p38 MAPK的重要下游激酶，MK2與脂代謝和炎性信號密切相關，能明顯影響炎癥因子表達，從而影響血脂調節［3］。流行病學資料顯示，不同種族血脂水平有著很大差異［4］，不同性別間也有差異，在血脂異常人群中關于MK2的研究不多。維吾爾族約占新疆總人口的45%，該民族人口流動性小，是一個相對隔離的群體，維吾爾族血脂異?；疾÷矢哌_34.8%［5］，在眾多心血管病危險因素中處于重要地位，因此，本研究選擇新疆和田地區維吾爾族人為研究對象，探索MK2基因44890c/t、rs 45514798單核苷酸多態性(single nueleotide polymorphism，SNP)與新疆和田地區維吾爾族人不同性別間LDC的相關性。

對象和方法

對象2007年1月至3月在新疆和田地區采用整群隨機抽樣調查方法，選取年齡30～70歲，3代內無通婚史的維吾爾族居民作為調查對象進行血脂異常的流行病學現況調查。共抽取了945名維吾爾族居民作為調查對象并完成調查，其中，男350人，女595人，本研究經新疆自治區人民醫院、和田地區衛生局及政府相關醫學倫理委員會同意，所有調查對象均簽署知情同意書。

一般資料收集所有研究對象均進行問卷調查、體格檢查和有關生化指標檢測。按統一設計的調查表采用同一方式進行問卷調查。調查表內容包括:一般情況、吸煙、飲酒、飲食情況、生活方式、糖尿病病史等。體格測量包括身高、體重、腰圍、臀圍等，兩次測量的身高、體重、腰圍、臀圍平均值被用于進一步數據分析。血脂異常診斷標準采用2007年《中國成人血脂異常防治指南》［6］推薦標準:總膽固醇: ＜5.18 mmol/L為正常，≥5.18 mmol/L為異常;LDLC:＜3.37 mmol/L為正常，≥3.37 mmol/L為異常;三酰甘油: ＜1.7 mmol/L為正常，≥1.7 mmol/L為異常;高密度脂蛋白膽固醇 (high density lipoprotein cholesterol，HDL-C): ＜1.04 mmol/L為異常，≥1.04 mmol/L為正常。

生化指標檢測及DNA提取所有研究對象均留取清晨空腹靜脈血樣，迅速低溫離心血漿并-20℃保存。血樣所有生化指標 (包括血糖、血脂、腎功能、胰島素等)由新疆維吾爾自治區人民醫院檢驗科同批次專人檢測完成，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)的測定采用北京北方生物技術研究所提供的TNF放射免疫試劑盒?；蚪MDNA提取按照基因組DNA提取試劑盒 (Paxgene blood DNA kit，AQIAGEN/BD Company，Franklin Lakes，NJ，USA)說明書進行，提取的DNA于-80℃保存備用。

MK2基因變異篩查及基因型鑒定在48例無親緣關系的維吾爾族人中，采用美國ABI公司3100XL基因分析儀對MK2基因的所有外顯子、外顯子-內含子交界區、5'和3'非編碼區至1 kb(untranslated regions，UTRs)序列進行PCR擴增及測序分析，測序結果通過Sequencher 4.7基因序列分析軟件與MK2基因組標準序列進行比對，找出變異位點并明確其在基因序列中的位置及變異性質，利用專業遺傳學分析軟件SNPAlyze Ver.7.0.1 pro(日本)分析各個變異位點間的連鎖不平衡關系，選擇最小等位基因頻率 (minor allele frequency，MAF)≥5%的常見變異位點和低頻的錯義突變。采用Taqman PCR技術，使用ABI 7900HT(Applied Biosystems，美國)對MK2基因的SNP位點進行基因分型。PCR的反應體系:總體積25 μl，其中人類TaqMan基因SNP分型預混液 (Applied Biosystems，美國)12.5 μl、SNP分型探針/引物預混液 (Applied Biosystems，美國)1.25 μl、DNA 模板 (20 mg/L)2 μl、去離子水9.25 μl。反應條件:95℃ 10 min預變性;92℃ 15 s變性，60℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，43個循環;72℃ 7 min總延伸?；蚍中偷淖x取率為98.9%，重復檢測的一致率為100%。

統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，組間均數的比較用t檢驗，病例對照組的基因型頻率分布采用χ2檢驗，不同基因型間血脂水平的差異采用方差分析，相關性分析采用線性回歸，P＜0.05為差異有統計學意義。Hardy-Weinberg平衡檢驗、連鎖不平衡 (linkage disequilibrium，LD)分析采用SNP Alyze7.0專業版 (DYNACOM Co.Ltd.，Mobara，Japan)軟件完成。

結 果

MK2基因功能區測序分析及TaqMan分型結果對48例維吾爾族血脂異?；颊進K2基因功能區測序，共發現7個變異位點，其中，內含子區5個［43364g/a、43896g/a(rs 45514798)、44517t/-(rs 35720082)、44890c/t、46044a/g］，外顯子區2個 ［46469c/t(rs 4073250)、47225c/g(rs 3813961)］。根據變異位點的LD關系和MAF，共選取3個變異位點 ［43896g/a(rs 45514798)、44890c/t、46469c/t(rs 4073250)］進行基因型鑒定，其中46469c/t(rs 4073250)位點TaqMan-PCR分型失敗 (僅分型出TT基因型，未分型出GG或GT基因型)(表1)。

不同性別間一般資料比較新疆和田地區維吾爾族男性年齡、腰圍、總膽固醇、LDL、三酰甘油、吸煙、飲酒均明顯高于女性人群，差異有統計學意義 (P＜0.05)，但是男女間TNF-α平均水平差異無統計學意義 (P=0.207)(表2)。

表1 48例血脂異?；颊進K2基因功能區測序分析Table 1 Polymorphisms of the MK2 gene in 48 dyslipidemia subjects

不同性別間維吾爾族正常組和高LDL-C組基因型頻率及等位基因頻率分布比較經檢測基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡，MK2基因 44890c/t、rs 45514798突變在不同性別的兩組人群中基因型分布及等位基因頻率44890c/t、rs 45514798基因型及等位基因分布在高LDL-C組和對照組中差異無統計學意義 (P＞0.05)(表3)。

表2 不同性別間一般資料比較Table 2 Comparison of general date between males and females

不同性別間MK2基因44890c/t、rs 45514798各種基因型與表型資料的比較男性中44890c/t位點不同基因型間年齡、總膽固醇、TNF-α差異有統計學意義 (P均＜0.05)，44890c/t中TT基因型攜帶者總膽固醇 (P=0.026)和 TNF-α水平 (P=0.006)均明顯高于CC基因型攜帶者，CT基因型攜帶者總膽固醇水平也高于CC基因型攜帶者 (P=0.031)，LDL-C在3種基因型間有增高的趨勢，但差異無統計學意義 (P＞0.05)。在顯性模型中，CT+TT型與CC型相比，總膽固醇 (P=0.012)與 TNF-α(P=0.002)的差異均具有統計學意義。在女性中，顯性模型分析提示，44890c/t基因型CT+TT型與CC型相比三酰甘油水平差異有統計學意義 (P=0.021)，其余血脂水平及TNF-α水平差異均無統計學意義(P均＞0.05)。rs 45514798在男性及女性中總膽固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油、體重指數 (body mass index，BMI)、TNF-α差異均無統計學意義 (P均＞0.05)(表4)。

MK2基因SNPs和LDL-C異常相關性分別以LDL-C和TNF-α水平作為因變量，采用線性回歸分析與上述兩指標相關的因素，在男性中，回歸方程為:LDL-C=0.142+0.089 BMI+0.029 TNF-α，對方程內BMI及TNF-α單獨檢驗，BMI和TNF-α對LDL-C水平有影響(P ＜0.05);TNF-α =6.247+1.347(44890c/t)，對方程內自變量單獨檢驗，44890c/t對TNF-α水平有影響 (P＜0.05);在女性中，所得回歸方程為:LDL-C=0.408+0.016 age+0.028 BMI+0.522腰臀比，對方程內自變量單獨檢驗后，發現年齡、BMI、腰臀比對LDL-C水平有影響 (P＜0.05)。

討 論

表3 MK2基因44890c/t、rs 45514798位點基因型及等位基因頻率在不同性別維吾爾族正常對照組和高低密度脂蛋白膽固醇組的分布Table 3 Distribution of the genotype and allele frequencies of MK2 gene 44890c/t and rs 45514798 in the normal control group and high LDL-C group in males and females

由于HapMap數據庫中無維吾爾族人的遺傳信息，數據庫中MK2基因的標簽SNPs對維吾爾族人無特異性，故本研究策略是測序篩查維吾爾族人MK2基因功能區的變異位點，這樣既可以發現民族特異性的常見變異，也能發現低頻率的錯義突變，然后選取代表性變異位點進一步在流行病學調查獲取的維吾爾族自然人群中進行基因型分型及關聯分析、臨床特征分析。目前關于MK2與血脂的研究多在動物實驗中進行，在少數民族與血脂紊亂人群中暫未見相關研究報道，本研究調查了MK2基因在新疆和田地區維吾爾族人群血脂異常發病中的作用。

表4 不同性別之間MK2基因兩個位點44890c/t、rs 45514798各種基因型與表型資料的比較 (±s)Table 4 Comparison of genotypes and phenotypes between the MK2 gene foci 44890c/t and rs 45514798 between males and females(±s)

表4 不同性別之間MK2基因兩個位點44890c/t、rs 45514798各種基因型與表型資料的比較 (±s)Table 4 Comparison of genotypes and phenotypes between the MK2 gene foci 44890c/t and rs 45514798 between males and females(±s)

a年齡中CT與CC比較差異有統計學意義 (P=0.017)，TT與CT比較差異有統計學意義 (P=0.006);b總膽固醇中CT與CC比較差異有統計學意義 (P=0.031)，TT與CC比較差異有統計學意義 (P=0.026);cTNF-α中CT與CC比較差異有統計學意義 (P=0.018)，TT與CC相比差異有統計學意義 (P=0.000)，TT與CT型比較差異有統計學意義 (P=0.047);d女性三酰甘油中CT與CC型相比差異有統計學意義 (P=0.037)Further LSD pairwise comparisons showed:aCT and CC(P=0.017)and TT and CT(P=0.006)was significant different in age;bCT and CC(P=0.031)and TT and CT(P=0.026)were significantly different in total cholesterol;cCT and CC(P=0.018)，TT and CC(P=0.000)，and TT and CT(P=0.047)were significantly different in TNF-α;dCT and CC was significant different in triglyceride in femal(P=0.037)

項目Item n 年齡(歲)Age(year)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)BMI(kg/m2)TNF-α(ng/L)男性Male 44890c/t CC 129 52.89±10.45 4.35±1.20 1.04±0.47 2.64±1.16 1.69±1.38 27.10±4.25 106.63±62.39 CT 163 49.97±10.24 4.69±1.34 1.07±0.35 2.81±1.28 1.70±2.42 27.61±4.50 128.44±86.15 TT 52 56.54±10.64a 4.83±1.44b 1.08±0.36 3.04±1.32 1.80±1.33 27.32±4.35 153.06±82.99c P 0.007 0.033 0.792 0.134 0.859 0.483 0.001 Dom 44890c/t CC 129 52.89±10.45 4.35±1.20 1.04±0.47 2.64±1.16 1.69±1.38 27.10±4.25 106.63±62.39 CT+TT 215 51.08±10.50 4.72±1.36 1.07±0.35 2.86±1.29 1.72±1.26 27.45±4.10 134.40±85.86 P 0.121 0.012 0.496 0.104 0.818 0.468 0.002 rs 45514798 GG 285 51.52±10.54 4.63±1.36 1.08±0.41 2.82±1.27 1.68±1.21 27.35±4.42 124.24±76.49 AG 57 52.33±10.73 4.35±1.09 0.99±0.34 2.58±1.16 1.86±1.72 26.88±3.86 125.56±90.88 AA 3 57.00± 6.93 4.68±0.94 1.07±0.23 2.32±0.20 1.88±0.96 30.67±6.03 55.14±26.19 P 0.593 0.339 0.302 0.340 0.634 0.307 0.316 Domrs 45514798GG 285 51.52±10.54 4.63±1.63 1.08±0.41 2.82±1.27 2.74±1.45 27.35±4.42 12 0.485 0.159 0.131 0.154 0.339 0.651 0.845女性4.24±76.49 AG+AA 60 52.57±10.58 4.36±1.08 0.99±0.33 2.70±0.49 2.70±0.49 27.07±4.01 122.04±90.01 P Female 44890c/t CC 234 49.18±10.77 4.40±1.32 1.08±0.35 2.42±1.11 1.64±1.15 27.19±4.16 133.45±79.06 CT 263 48.83±10.76 4.35±1.17 1.07±0.34 2.36±0.99 1.46±0.84d 26.80±4.58 130.39±86.90 TT 93 49.46±10.35 4.39±1.37 1.08±0.37 2.43±1.05 1.43±0.85 27.15±4.37 122.53±80.58 P 0.866 0.913 0.970 0.761 0.068 0.578 0.089 Dom 44890c/t CC 234 49.18±10.77 4.40±1.32 1.08±0.35 2.42±1.11 1.64±1.15 27.18±4.16 133.45±79.06 CT+TT 356 48.99±10.64 4.36±1.22 1.08±0.35 2.38±1.00 1.45±0.84 26.89±4.52 128.34±85.25 P 0.835 1.720 0.870 0.627 0.021 0.417 0.464 rs 45514798 GG 475 49.25±10.85 4.36±1.25 1.08±0.34 2.39±1.05 1.51±0.90 27.35±4.42 129.94±83.16 AG 104 48.09±10.05 4.44±1.32 1.08±0.38 2.43±1.05 1.56±1.26 26.88±3.86 131.64±82.84 AA 11 50.55± 9.63 4.64±1.20 1.06±0.37 2.22±1.21 2.05±1.07 30.67±6.03 136.48±74.06 P 0.544 0.663 0.984 0.790 0.174 0.359 0.953 Domrs 45514798GG 475115 49.25±10.85 4.36±1.25 1.08±0.34 2.39±1.05 1.51±0.90 26.92±4.3 0.406 0.448 0.910 0.822 0.333 0.317 0.802 9 129.94±83.16 AG+AA 48.32± 9.99 4.46±1.30 1.07±0.37 2.41±1.06 1.60±1.24 27.38±4.36 132.10±81.75 P

影響血脂代謝因素很多，其中包括遺傳基因作用以及生活環境影響 (飲食條件和生活習慣)。主流觀點認為血脂異常是一種低度炎癥反應，同時許多資料顯示炎癥反應在動脈粥樣硬化發生發展中有十分重要的作用，本研究所涉及MK2基因在炎癥相關疾病中的關鍵作用已在體外和體內實驗中得到證實［7-8］。已有報道血脂異常在不同性別之間存在差異［9］，在新疆維吾爾族人群中不同性別中也同樣有差異［10］，本研究結果顯示，男性中MK2基因44890c/t TT型與總膽固醇及TNF-α有關聯 (CC＜CT＜TT)，但未發現44890c/t與LDL-C水平存在關聯，僅存在增高趨勢 (CC＜CT＜TT);女性中MK2基因44890c/t與三酰甘油有關聯 (CC＞CT+TT)，說明MK2基因多態性分布在不同性別間存在差異，與既往研究報道一致。周玲等［4］通過對新疆少數民族血脂調查發現，新疆少數民族高總膽固醇現患率男性為23.01%、女性為14.05%，高三酰甘油現患率男性為13.06%、女性為4.0%。本研究結果顯示，44890c/tTT型是男性高總膽固醇危險基因型，44890c/t位點TT基因型的男性LDL-C水平也較CC及CT基因型高，而44890c/tTT型則是女性高三酰甘油的保護基因型。進一步分析發現，44890c/t、rs 45514798多態基因型分布在高LDL-C和對照組中差異均無統計學意義。本研究發現在男性中，BMI、TNF-α可能對LDL-C水平有影響，是可能的危險因素，44890c/t位點可能對TNF-α水平有影響;在女性中，年齡、BMI、腰臀比對LDL-C可能有一定影響。但本研究中選擇44890c/t的SNP及等位基因分布與LDL-C無統計學意義相關，可能需要擴大樣本量來進一步驗證，也可能MK2基因在功能上與炎癥相關，血脂異常為輕度炎癥反應，而本研究所選擇TNF-α容易受多種因素影響，同時可能本研究選的人群和民族的異質性有關，這也需要在其他人群和民族中去進一步驗證。

維吾爾族人約占新疆總人口的45%，該民族人口流動性小，是一個相對隔離的群體，血脂異常在維吾爾族人眾多心血管病危險因素中處于重要地位，決定人群血脂水平差異的原因可能是膳食結構、經濟狀況和社會環境，維吾爾族主要膳食結構為羊肉和乳制品，因而屬于血脂異常的高發群體。性別分析發現，肥胖均是導致男女高LDL-C的可能危險因素，男性中TNF-α是導致高LDL-C的危險因素，可能和男性中MK2的44890c/t中TT基因型對TNF-α水平有一定的影響有關，也可能與該民族男性嗜酒者多，伴有吸煙、喜食高熱量食物較多有關［11］。

綜上，本研究結果顯示 MK2基因44890c/t、rs 45514798多態性與新疆維吾爾族人LDL-C水平不相關，可能存在的原因有種族的差異與位點選擇的不同，因此，在今后的研究中應繼續發現潛在的基因位點，MK2基因的2個位點及其他位點在其他民族血脂異常中的作用有待進一步研究。

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