結核分枝桿菌北京基因型菌株大片段的多態性研究

謝彤 孫蕊 巨韓芳 王春花 穆成 王志銳 趙慧

結核病的分子流行病學研究提示，受環境和宿主因素的影響，全球不同地區流行的主要結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的主要基因型并不相同。在所發現的MTB基因型中，北京基因型的流行在全球傳播的范圍最廣[1]。北京基因型MTB菌株與其他基因型菌株相比，該基因型在低流行區更容易在人群中發生近期傳播，從而導致感染該基因型的結核病患者比例呈逐年升高的趨勢[2]。北京基因型MTB較其他基因型菌株更容易產生耐藥，而產生的耐藥菌株又促進了北京基因型MTB在人群中的傳播，因此，在有些地區的流行病學研究顯示，北京基因型與耐藥結核病、特別是耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的傳播密切相關[3]。我國是北京基因型MTB的高流行區，特別是在北方地區，大約90%臨床分離的MTB菌株屬于北京基因型，是全球已報道北京基因型MTB流行最高的地區[4]。

對基因組分析證實，北京基因型MTB在進化過程會發生插入序列6110(IS6110)的轉位和特異性的差異區域(region of difference，RD)缺失。根據該基因型菌株基因組NTF(noise transfer function)區域中IS6110是否存在，北京基因型被分為古代與現代兩個亞型[5]。北京基因型古代株的NTF區中沒有IS6110，而北京基因型現代株NTF區中至少含有1個IS6110。此外，不同的北京基因型菌株在進化過程中還會出現不同的RD片段缺失，由此產生菌株大片段多態性。依據不同MTB菌株基因組中RD181、RD150以及RD142的缺失情況，北京基因型被分為5個進化分支[6]。筆者對天津地區臨床實驗室分離培養獲得的北京基因型MTB菌株基因組中RD片段的多態性與NTF區中IS6110進行分析，以期揭示在天津地區流行的北京基因型菌株所形成的各個分支及其流行的狀況。

材料和方法

1.菌株來源：選取天津市結核病參比實驗室收集的2014年1月至2016年6月從天津地區結核病患者痰標本中分離培養的北京基因型MTB，共567株。其中，308株分離培養自天津市區(和平區、河東區、河西區、南開區、河北區和紅橋區)結核病患者，221株分離培養自濱海新區(包括塘沽、漢沽、大港)、環城區(包括東麗、西青、津南、北辰)及其他區縣(包括武清、寶坻、寧河、薊州)，38株分離培養自監獄局系統結核病患者。所有菌株經對硝基苯甲酸試驗和噻吩-2-羧酸肼培養基生長試驗，排除非結核分枝桿菌和牛分枝桿菌。H37Rv標準株購自中國藥品生物制品檢定所。

2. MTB基因組提?。号R床分離培養的MTB菌落轉移至裝有450 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)的1.5 ml Eppendorf管中，細菌經80 ℃、60 min滅活與溶菌酶消化后，采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)提取菌株的基因組DNA[7]。提取后的基因組DNA溶于1×TE緩沖液中，基因組提取所需試劑均購自美國Sigma公司。

3. 北京基因型MTB鑒定：根據北京基因型MTB的基因組中RD207缺失這一特征，通過多重PCR試驗分析菌株基因組在Rv2616至Rv2819區域的缺失情況。在PCR反應體系中同時加入2對引物，分別針對北京基因型基因組中的Rv2820區域和北京基因型菌株基因組中缺失的Rv2819區域。25 μl PCR反應體系中包括2×Taq Master-Mix 12.5 μl(購自北京天根生化科技有限公司)、終濃度為0.4 μmol/L的引物及10～50 ng的菌株基因組DNA。若MTB為北京基因型，則PCR產物擴增片段長度為393 bp；而非北京基因型PCR擴增產物片段長度為570 bp[7]。

4.基因組NTF區域IS6110分析：北京基因型菌株基因組NTF 區IS6110 插入序列的分析采用Wada等[8]報道的方法。使用上游引物MDR-6與下游引物MDR-6r分析NTF 區是否存在IS6110，如果含有IS6110，則為現代株，其擴增產物為1.5 kb；反之則為古代株，其擴增產物為302 bp。

5.RD多態性分析：采用多重PCR分別分析北京基因型菌株基因組中RD105、RD181、RD150與RD142差異區域的缺失情況，根據PCR反應擴增產物的長度確定RD序列的缺失或完整，引物序列參考Reed等[9]的報道。在50 μl PCR反應體系中含有25 μl的Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶(購自北京NEB有限公司)，2.4 μl 10 μmol/L的引物，以及10～50 ng的基因組DNA。PCR反應條件為95 ℃ 變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環；72 ℃反應10 min。

結 果

1.基本情況：567株MTB臨床分離株中，517株為北京基因型，占91.2%，是絕對的優勢菌株。對517株北京基因型菌株NTF區IS6110分析，70株(13.5%)為古代株，即菌株的NTF區不含有IS6110；447株(86.5%)為現代株，其基因組NTF區中存在IS6110。

2.基于大片段多態性的進化分支：517株北京基因型菌株根據基因組中NTF區IS6110的存在情況和RD的多態性被分為5個進化分支(表1)。本研究中所有的北京基因型菌株基因組中均發生RD105缺失?；蚪M中存在RD181片段的RD181(+)菌株被認為是北京基因型早期進化分支，在所有的北京基因型菌株中RD181(+)菌株為22株(4.3%)，RD181(-)的北京型菌株為495株(95.7%)。RD181(-)菌株中，基因組NTF區無IS6110的北京基因型古代株為41株，占全部北京基因型菌株的7.9%。22株RD181(+)的菌株中，其基因組NTF區均無IS6110序列，即均為北京基因型古代株。在447株北京基因型現代菌株中，404株基因組中存在完整的RD150序列，占全部北京基因型菌株的78.1%；43株為RD150缺失的北京基因型現代株，占全部北京基因型菌株的8.3%，占全部北京基因型現代株的9.6%(43/447)。70株北京基因型MTB古代株中，同樣發現有7株基因組發生RD150缺失，占全部北京基因型古代株的10.0%(7/70)。由此可見，根據大片段多態性分析天津地區流行的北京基因型MTB被分為5個分支，其中RD181(-)/RD150(+)的北京基因型現代株所占的比率最高，是北京基因型的主要流行分支(圖1)。RD142差異序列存在于所有分析的北京基因型菌株基因組中。

討 論

MTB在長期進化過程中其基因組會發生大片段的轉位插入或缺失，而這一變化可能會影響菌株的毒力和宿主對MTB的免疫，使某些菌株更容易在人群中傳播流行，在這一地區形成優勢菌株，造成全球不同區域流行的MTB主要基因型也各不相同。全球范圍內，不同地區進化出至少6個基因型，每個基因型的MTB基因組中都存在特異性的RD缺失序列。因此，通過分析菌株基因組中這些特異性的RD缺失序列，可以鑒定MTB所屬的基因型[10-11]。對從99個國家和地區流行的北京基因型MTB的分子流行病學研究發現，該基因型大約在6600年前起源于包括我國東北在內的東亞地區，隨著近代大規模人口遷徙的路徑逐漸擴散至全球各地[12]。北京基因型MTB的重要特征為RD207和RD105片段的缺失。雖然Rindi等[13]的研究發現，極少數北京基因型MTB基因組中含有RD105差異序列，但在我國流行的北京基因型菌株基因組中還未發現含有RD105的報道，因此檢測RD207和RD105缺失情況可用于鑒定北京基因型MTB。

表1 517株5個分支北京基因型結核分枝桿菌菌株大片段多態性分析結果

注“+”：表示完整；“-”：表示缺失

矩形框中表示在菌株進化過程中RD序列的缺失和IS6110在NTF區的插入圖1 北京基因型結核分枝桿菌進化途徑和所形成的進化分支

根據 RD片段多態性研究提出的北京基因型進化途徑中，MTB菌株首先發生RD207缺失進化成為北京基因型，隨后幾乎所有的北京基因型菌株發生RD105缺失。在以后的持續進化過程中不同的菌株按順序可能出現RD181、RD150和RD142的缺失[13]。本次研究顯示，RD181缺失的北京基因型菌株為495株，占95.7%，高于我國東部地區。對東部地區不同省市結核病患者臨床分離北京基因型菌株的兩項流行病學研究中，RD181(-)菌株僅占全部北京基因型菌株的67.8%和87.0%，提示北京基因型各個進化分支的菌株在我國不同地區的流行情況存在差異[14-15]。根據基因組NTF區中IS6110的存在與否，將北京基因型菌株分為古代株(IS6110缺失)和現代株(IS6110存在)。本研究的菌株中北京基因型的現代株為447株(86.5%)，與文獻報道我國東部地區現代株所占全部北京基因型菌株的87.1%相近[15]。

基于RD片段的多態性和IS6110在NTF區的插入情況，本次研究中的517株北京基因型MTB被分為5個分支，其中RD181(-)/RD150(+)的北京基因型現代株這一分支所占的比率最高(78.1%)。22株RD181(+)的菌株全部為北京基因型古代株，提示北京基因型菌株在進化過程中首先發生RD181的缺失，然后才出現IS6110在NTF的插入，進化順序與其他研究報道的結果一致[13,16]。本次研究發現7株RD150(-)的北京基因型古代株，這是基于大片段多態性分析北京基因型MTB進化研究中首次發現的進化分支，同時研究數據顯示RD150(-)的菌株在北京基因型MTB古代株和現代株的比例非常接近，分別占10.0%(7/70)和9.6% (43/447)，提示RD150大片段的缺失并不僅出現在北京基因型現代株中，而是在菌株進化成為現代株與古代株2個分支后，這2個分支的MTB在傳播過程中均有少量的菌株(大約10%)進一步發生RD150的缺失。筆者對基因組中大片段多態性分析表明，北京基因型菌株的進化路徑為MTB首先發生RD207和RD105缺失進化成為北京基因型，隨后出現RD181片段的缺失，然后發生IS6110序列在NTF區的插入形成現代北京基因型菌株；少量(大約10%)的古代北京基因型和現代北京基因型菌株在隨后的進化過程中出現RD150的缺失。Tsolaki等[6]的研究發現部分北京基因型菌株可能會出現RD142缺失。筆者的研究結果顯示北京基因型菌株基因組均含有完整的RD142序列，其他一些國內外關于北京基因型進化的研究中，同樣也未發現RD142缺失的MTB[13-14]，提示RD142差異片段在北京基因型菌株中的多態性較低。

雖然在少數國家流行的北京基因型MTB以古代株為主，但在我國和全球的大部分地區北京基因型現代株的流行更為廣泛[12]。分子流行病學調查證實，北京基因型現代株容易在人群發生近期傳播和暴發流行。這一北京基因型分支更容易流行的機制還未完全闡明，與北京基因型古代株相比，RD150(+)的北京基因型現代菌株在誘導巨噬細胞產生免疫應答時，巨噬細胞釋放各類細胞因子水平明顯降低[17]。小鼠感染實驗證實RD150(+)北京基因型現代株較北京基因型古代株會對肺組織造成更大的病理損傷，提示這一進化分支具有更強的毒性[18]。此外，大規模的人群流行病學研究提示，北京基因型現代株較該基因型的古代株更容易逃避卡介苗接種所產生的免疫反應，因此卡介苗的接種可能會促進北京基因型現代株在人群中的傳播[19]。上述的研究提示，鑒于天津地區流行的北京基因型分支為RD150(+)的現代株，而這一流行特點會為天津地區結核病的預防和治療工作提出更大的挑戰。同時本研究結果也說明，非常有必要在我國的其他地區開展對北京基因型各個亞型菌株流行的監測工作。

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