鼠李糖乳桿菌KF7產單胺氧化酶抑制劑培養條件的優化*

孟春，吳正鈞，郭本恒，韓瑨

1(光明乳業股份有限公司乳業研究院乳業生物技術國家重點實驗室，上海，200436)2(上海海洋大學食品學院，上海，201306)

單胺氧化酶(MAO;EC 1.4.3.4)作為一種主要分布于線粒體外膜的黃素蛋白酶，在人體中能夠對內源性和外源性胺類物質氧化脫氨產生醛類和水［1］，按照對底物和抑制劑的特異性及分布位置不同，MAO可分為MAO A和MAO B兩種亞型。一些報道稱抑郁癥、帕金森病和阿爾茨海默病等疾病與MAO在體內含量或活性過高有關，能夠抑制酶活性的MAO抑制劑(MAOIs)可以作為二線藥物來治療此類精神疾病和神經系統疾病。MAOIs治療憂郁癥具有一定的優勢，具有持久并且緩和的特點，不容易從興奮轉變成抑制作用，這與其他的中樞興奮劑有所不同［2］。

目前天然的MAOIs主要是從不同的植物中提取得到，比如胡椒屬的蓽拔［3］、烏蘞莓屬的烏蘞莓［4］、龍膽屬的黃龍膽［5］和薄荷屬的水薄荷［6］等一些植物，天然MAOIs可以推動合成藥物的發展。對乳酸菌發酵液的MAO抑制作用的報道比較少，Shen［7］等從廣西長壽之鄉巴馬的健康百歲老人糞便中分離出1株雙歧桿菌，并研究這株乳酸菌的MRS發酵上清液、菌體和無細胞抽提液的抗氧化活性，體內實驗對老齡小鼠進行灌胃，其中一個指標測定大腦中MAO的活性，發現MRS發酵上清液、菌體和無細胞抽提液均能有效降低MAO的活性。本實驗室對乳酸菌抑制MAO活性的研究也有一定的成果，第一階段［8］從健康人體糞便中分離出1株干酪乳酸菌JH23，其MRS發酵上清液對MAO具有較高的抑制率，確定具有MAO抑制作用的是小分子物質。第二階段［9］從干酪乳桿菌JH23的MRS發酵液中分離純化出具有MAO抑制作用的物質琥珀酸。由于干酪乳桿菌JH23在脫脂乳中生長緩慢，24h無凝乳現象，脫脂乳發酵液幾乎無MAO抑制作用，所以選定幾株實驗室保藏的24h內能夠在脫脂乳中凝乳的乳酸菌，對其發酵液的MAO抑制作用進行比較，最后選擇一株具有優勢的鼠李糖乳桿菌KF7(Lactobacillus rhamnosus KF7)作為目的菌株。

本實驗在單因素實驗的基礎上，利用Design Expert8.0軟件進行響應面實驗設計和分析，確定最佳發酵條件，得到具有較高MAO抑制作用的鼠李糖乳桿菌KF7的發酵液。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌KF7(Lactobacillus rhamnosus KF7)等菌種，實驗室保藏;單胺氧化酶(MAO)，實驗室自制;犬脲胺(Kynuramine dihydrobromide)，Sigma公司;脫脂乳粉，光明新西蘭奶粉廠;KH2PO4，分析純;K2HPO4:分析純;其他試劑均為實驗室常規分析純化學試劑。

1.2 儀器與設備

TH-CB-402超凈工作臺:LABCONCO公司;HVE-50高壓蒸汽殺菌鍋，日本HIRAYAMA公司;Bug Box厭氧培養箱，RUSKINN公司;GNP-9270隔水式恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司;MDF-U超低溫冰箱，日本 SANYO公司;Spectra M5酶標儀，美國Molecular Devices公司;AVANTI J30I高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單胺氧化酶的制備及單胺氧化酶抑制劑活性的測定

單胺氧化酶粗酶的實驗室制備根據Stafford［10］等的方法，從Wistar雄性老年大鼠的肝組織勻漿中采用差速離心法在低溫條件下分離獲得，得到的粗酶液低溫保存。

MAO 活性的測定［11－13］:以犬脲胺為底物，在 96孔板中分別加入120 μL磷酸鉀緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4 ～7.6)，30 μL 待測樣品，20 μL 粗酶液和30 μL的犬脲胺底物(1 mmol/L)，混勻。反應體系在37℃反應60 min，在波長360 nm下測得初始吸光值(I1)和反應結束后的吸收值(I2)，空白對照用水替代待測樣品(△I0)。

1.3.2 種子液及發酵液制備

將脫脂乳凍存的菌種通過劃線法在MRS瓊脂上活化，在37℃厭氧培養箱中培養48 h，待菌落長到一定大小后取出，用相同方法再活化一代備用。挑取新鮮培養的菌落接種于5 mL濃度為10%的脫脂乳中，37℃培養24 h左右作為種子液。

將種子液按一定量接種于100 mL濃度為10%的脫脂乳中，在指定溫度下培養一定時間取出。將經過發酵后的脫脂乳以9 000 r/min離心20 min，取上清液，作為待測樣品，存儲于－20℃備用。

1.4 單因素實驗

1.4.1 接種量對Lb.rhamnosus KF7產MAO抑制劑的影響

分別按1%、2%、3%、4%、5%的比例將新鮮種子液接種到10%(w/w)脫脂乳中，37℃培養48 h取出，測定發酵液上清對MAO的抑制率。

1.4.2 培養溫度對Lb.rhamnosus KF7產MAO抑制劑的影響

將新鮮種子液按4%的比例接種到濃度為10%(w/w)脫脂乳中，分別在 28、31、34、37、40 ℃5 個不同溫度培養48 h后取出，測定發酵液上清液對MAO的抑制率。

1.4.3 發酵時間對Lb.rhamnosus KF7產MAO抑制劑的影響

將新鮮種子液按4%的接種量接種到濃度為10%(w/w)的脫脂乳中，在37℃分別培養12、24、48、72、96、120 h后取出，測定發酵液上清對 MAO 的抑制率。

1.4.4 脫脂乳濃度對Lb.rhamnosus KF7產MAO抑制劑的影響

以4%的接種量將新鮮種子液分別接種到4%、6%、8%、10%、12%(w/w)的脫脂乳中，在37℃培養48 h后取出，測定發酵液上清對MAO的抑制率。

1.5 響應面法優化Lb.rhamnosus KF7產MAO抑制劑的發酵條件

采用Design Expert8.0軟件進行Box-Behnken響應面實驗設計，選取接種量、培養溫度和培養時間3個因素，分別用A、B和C進行編碼，選取的3個水平用－1、0、1編碼，實驗設計及水平見表1。

表1 響應面實驗設計因素及水平表Table 1 The range of independent variables and their corresponding levels

2 結果與分析

2.1 幾株乳酸菌的脫脂乳發酵液對MAO的抑制作用

選取1株干酪乳桿菌(LC2w)、1株鼠李糖乳桿菌(KF7)、1株嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)、1株乳酸乳球菌(Lc.lactis)、1株瑞士乳桿菌(Lb.helveticus)和1株保加利亞乳桿菌(LB340)，在MRS平板上活化后，以4%接種量接種到10%的脫脂乳中，培養48 h，取上清液，分別測定上清液和空白10%脫脂乳的MAO抑制作用，結果如圖1?？梢钥闯鯧F7相對于其他菌株具有更高的MAO抑制作用，抑制率為(59.75±1.61)%，因而選擇KF7作為目的菌株進一步研究。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 接種量對MAO抑制率的影響

圖1 幾株乳酸菌發酵脫脂乳上清液和空白脫脂乳對MAO的抑制作用Fig.1 MAO inhibitory effect of fermented skim milk supernatant by the tested strains and blank skim milk

接種量對于微生物的生長和代謝產物的積累具有一定的影響。將Lb.rhamnosus KF7按不同比例接種到10%(w/w)脫脂乳中，在37℃下培養48 h后，發酵脫脂乳對MAO的抑制作用如圖2所示。當接種量較小時，發酵脫脂乳對MAO的抑制作用隨著接種量的增加而提高，當接種量為3%時，發酵液對MAO的抑制率達到最高;之后，隨接種量的繼續增加，抑制率出現小幅下降?？赡苁前l酵體系中活菌數量的大量增多，導致營養物質的快速消耗，同時乳酸等不利于菌體生長的有害代謝產物積累過快等因素，影響對MAO具有抑制作用的代謝產物形成和積累。

圖2 接種量對MAO抑制率的影響Fig.2 Effect of inoculum ration on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

2.2.2 培養溫度對MAO抑制率的影響

培養溫度是影響菌體生長的重要因素之一，適合的溫度有利于菌體的生長，菌體代謝活躍，促使代謝產物生成。培養溫度對Lb.rhamnosus KF-7在脫脂乳中發酵液抑制MAO活性的影響如圖3，溫度在28～34℃之間時，隨溫度的升高，發酵液對MAO的抑制率逐漸升高，在34℃達到最高，當溫度再繼續升高時，抑制率則會呈現下降趨勢。產生這種趨勢的可能原因是溫度低于或高于34℃時，菌體生長緩慢，因而菌體代謝產物的產生量相對菌體的較適生長溫度條件下的量會少。

圖3 培養溫度對MAO抑制率的影響Fig.3 Effect of culture temperature on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

2.2.3 培養時間對MAO抑制率的影響

培養時間對微生物積累代謝產物具有重要的影響，按照4%的接種量在37℃培養，隨時間變化發酵液對MAO抑制率的影響。從圖4可以得出，在72 h時發酵液對MAO的抑制率較高。隨時間增加抑制率逐漸降低，可能是對MAO具有抑制作用的有效物質發生降解。

圖4 培養時間對MAO抑制率的影響Fig.4 Effect of culture time on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

2.2.4 脫脂乳濃度對MAO抑制率的影響

脫脂乳濃度也是影響菌體生長的一個因素，為菌體生長提供碳源、氮源等生長所必須的營養物質，從圖5可以看出脫脂乳濃度為12%時，抑制率最高，與濃度為10%時的抑制率接近，從經濟角度考慮，為降低成本，選擇10%濃度的脫脂乳。

2.3 響應面分析優化鼠李糖乳桿菌KF7產單胺氧化酶抑制劑的培養條件

2.3.1 響應面實驗設計及結果

通過Design Expert8.0軟件的Box-Behnken實驗設計，選擇接種量、培養溫度和培養時間作為3個因素，進行3因素3水平設計，見表2。

圖5 脫脂乳濃度對MAO抑制率的影響Fig.5 Effect of concentration of skim milk on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

表2 響應面分析實驗設計和結果Table 2 Experimental design and result of Response surface analysis

2.3.2 響應面實驗方差分析及各因素顯著性分析

由表3方差分析可知該模型具有極高的顯著性(Pmodel＜0.0001)，說明本實驗選用的二次多項模型是可靠的，其決定系數(R2)=0.982 4，表明發酵液上清對MAO抑制率的實測值與預測值擬合較好。校正決定系數(R2Adj)=0.959 8，表明該模型能較好地解釋不同條件下發酵液上清對MAO抑制率的變化。另外，失擬項不顯著，因此可以用該模型得到的二次回歸方程對實驗結果進行分析［14］。

對實驗數據進行多項回歸擬合，得到發酵上清液的MAO抑制率對編碼自變量的二次多項回歸方程:

抑制率(%)=71.83+0.44A+2.06B+0.93C－0.13AB+1.23AC－2.39BC－0.90A2－3.73B2－3.61C2

另外，從表3可知，一次項B、C對抑制率分別具有極顯著性影響，A影響不顯著，交互項AB影響不顯著，AC影響顯著，BC影響極為顯著，A2影響顯著，B2、C2影響極顯著。說明響應值是受各因素交互影響的，而不是僅僅某一因素的影響。

表3 響應面回歸方程的方差分析Table 3 The analysis of variance for the polynomial model

2.3.3 響應面分析

響應面分析得到的三維曲面圖和等高線圖可以直觀地反映各因素對響應值的影響及各參數之間的相互作用，從響應曲面的最高點和等高線可以看出在所選的范圍內存在極值。如圖6所示，隨接種量和培養溫度的增大，抑制率是逐漸增大的，達到某一個值后，隨2個自變量的增大，抑制率則呈現下降趨勢。圖7和圖8顯示，抑制率隨2個自變量的變化同圖6具有相同的趨勢。

通過分析得到最佳條件的理論值為，接種量3.29%，培養溫度34.71℃，培養時間74.4 h，此培養條件得到MAO抑制率的理論值為72.18%?？紤]到實際條件，驗證實驗的最佳優化條件:接種量3.3%，培養溫度34.7℃，培養時間74 h。實驗重復3次，取平均值得MAO抑制率的驗證值為(71.98±0.16)%，與理論值接近(相對誤差為0.3%)，結果表明采用響應面分析法得到的發酵培養條件基本準確，具有實用價值。

圖6 接種量和培養溫度交互影響MAO抑制率的等高線圖及其曲面圖Fig.6 Contour plot and respective response surface plot of MAO inhibition rate of Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk affected by inoculum ratio and culture temperature

圖7 接種量和培養時間交互影響MAO抑制率的等高線圖及其曲面圖Fig.7 Contour plot and respective response surface plot of MAO inhibition rate of Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk affected by inoculum ratio and incubation time

圖8 培養溫度和培養時間交互影響MAO抑制率的等高線圖及其曲面圖Fig.8 Contour plot and respective response surface plot of MAO inhibition rate of Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk affected by culture temperature and time

3 結論與討論

單因素實驗表明隨接種量、培養溫度和培養時間的增大，發酵脫脂乳上清的MAO抑制率的趨勢是先增大后減小，通過單因素實驗找到每一個因素的較優點，從而在響應面實驗中能夠選取合適的水平。

本文通過Box-Behnken中心組合實驗對發酵條件進行優化，優化過程具有較高的準確性和精確性。通過對模型進行方差分析，顯示該模型能夠用于鼠李糖乳桿菌KF7產單胺氧化酶抑制劑的發酵條件的預測和分析。最終得到的最佳發酵條件為:接種量3.3%，培養溫度34.7℃，培養時間74 h，驗證得到的MAO抑制率為71.98%。

目前具有MAO抑制作用的天然產物主要是從植物中得到，采用微生物發酵方法制備MAO抑制劑的研究相對較少。人體多種精神和神經系統疾病都與MAO的失調有關，MAO抑制劑則起到緩解和治療作用，MAO抑制劑的研究和開發是具有醫學價值的，從天然產物到化學合成，得到了不同種類具有價值的MAO抑制劑。針對這一現狀，在前期的研究中，我們通過體外實驗發現鼠李糖乳桿菌KF7發酵脫脂乳的產物具有較高的MAO抑制作用。為了進一步的研究，首先通過對Lb.rhamnosus KF7產單胺氧化酶抑制劑的發酵條件進行優化，以提高發酵脫脂乳對MAO的抑制作用，從而為接下來的工作提供依據。

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