超高效液相色譜串聯質譜法測定水體與底泥中孔雀石綠及隱色孔雀石綠殘留

孫言春，李池陶，杜寧寧，曹頂臣，牟振波*，吳 松，王海濤，陳中祥

(1.中國水產科學研究院 黑龍江水產研究所/農業部水產品質量安全風險評估實驗室(哈爾濱)，黑龍江 哈爾濱 150070;2.哈爾濱工業大學 理學院，黑龍江 哈爾濱 150001)

孔雀石綠(Malachite green，MG)又名堿性綠、苯胺綠，曾作為一種工業染料廣泛用作羊毛、絲綢、皮革等的染色劑［1］。由于MG還具有殺滅真菌、寄生蟲等病原微生物的作用，在水產養殖中常用來預防和治療受精卵和成魚的水霉病、腮霉病和小瓜蟲病等，以及用于活魚運輸、池塘暫養過程和環境的消毒等［2－5］。然而，MG在生物體內有明顯蓄積現象且具有高毒、高殘留、致癌、致畸、致突變等毒副作用，對生物體的組織、生殖、免疫系統均有影響，尤其是其代謝產物隱色孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)毒性更大［6－12］。因此，包括歐美、中國在內的國家都明令禁止其在水產養殖中的應用［13］，以確保消費者健康和水產貿易的對外地位。

雖然MG在水產養殖中的違禁使用情況越來越少，但由于其曾經被廣泛應用，已對環境造成了嚴重污染，尤其是表層沉積物作為MG在環境中的最終歸宿，且不斷向水體進行緩慢釋放，成為其二次污染的主要來源［5，14－15］。因此，評估表層沉積物和水體中的MG及其代謝物殘留狀況，建立相應的分析方法，對于水產品中MG污染來源的排查具有積極的意義。

目前，針對水體、底泥等環境中的痕量MG及其代謝物的檢測方法相對較少，且主要采用靈敏度較低的液相色譜法［16－19］。由于底泥等沉積物的成份復雜，各種雜質多，對分析干擾大，高效液相色譜對樣品的凈化要求較高，整個操作步驟繁瑣、耗時長，不利于準確定性和定量分析。而高效液相色譜串聯質譜法由于靈敏度高、專屬性強，因此在MG藥物殘留檢測上獲得了廣泛的應用［20－23］。已有研究采用高效液相色譜串聯質譜法測定了水或底泥中MG和隱色LMG殘留［24－26］，但其前處理方法較繁瑣，不適合大批量樣品的檢測需要。

本研究充分利用高效液相色譜串聯質譜靈敏度高、專屬性強的優點，對水體及表層沉積物中的MG及其代謝物進行提取、濃縮，優化了前處理過程，能夠快速準確檢測出養殖水體及沉積物中殘存的痕量MG及其代謝物，可為污染來源排查及評價生態環境對健康養殖的影響提供可靠的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

AcquityTM超高效液相色譜儀，Micromass Quattro micro API三重四極桿質譜(配電噴霧離子源)，MassLynxTMV 4.1操作軟件(Waters公司);XS205電子天平(Mettler Toledo公司);GX271自動固相萃取儀(Gilson公司);Biofuge Stratos高速冷凍離心機(Thermo Scientific公司);T25 digital Ultra－Turrax均質機，MS1 Mini－shaker渦輪振蕩器(IKA公司);Milli-Q A10純水器(Millipore公司);移液器(200、1 000、5 000 μL，Eppendorf公司);PHS－3C pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

MG、LMG、MG-D5、LMG-D6(純度≥99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司);二氯甲烷(色譜純，美國Fluka公司);實驗用水由Millipore A10純水系統(美國Millipore公司)制備;乙酸銨(LC/MS級)、乙酸(色譜純)、甲酸(純度＞98%)均購自美國Fluka公司;N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺(TMPD，生物試劑)，濃鹽酸(分析純);固相提取小柱Agilent Accu-BOND SCX(美國Agilent公司，200 mg/3 mL)，Oasis MCX(美國Waters公司，150 mg/6 mL)，Oasis WCX(美國Waters公司，150 mg/6 mL)。

TMPD溶液(1.0 g/L):稱取50 mg TMPD溶于50 mL甲醇中;檸檬酸緩沖溶液(pH 2.6):10.5 g檸檬酸鹽溶入500 mL水中，配成0.1 mol/L檸檬酸鹽溶液;將14.2 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)溶于500 mL水中，配成0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液，將445.5 mL 0.1 mol/L檸檬酸鹽溶液和54.5 mL 0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液混合即可;標準溶液:準確稱取MG和LMG標準品及對應內標，用甲醇溶解并稀釋成100 mg/L的儲備液，室溫下可穩定3個月;儲備液用80%乙腈溶液(乙腈∶5 mmol/L的乙酸銨溶液=8∶2，體積比)作稀釋液配成1.0 mg/L的中間工作溶液，然后用該稀釋液將中間液配制成相應濃度的標準工作溶液;內標溶液使用前用稀釋液配成兩種物質濃度均為0.1 mg/L的混合溶液。

1.3 采樣方法

水樣采集:用廣口瓶取500 mL水樣，加入40 mL TMPD溶液，4 000 r/min離心5 min，超聲3 min，過0.45 μm尼龍濾膜。加入100 μg/L MG及LMG內標混合液50 μL，放置10 min，然后加入檸檬酸緩沖溶液(pH 2.6)和甲醇各30 mL。超聲10 min后，進行固相萃取。

底泥樣品采集:取表層沉積物樣品，用均質機充分均質后，稱取5.0 g，加入200 μL TMPD溶液和50 μL 100 μg/L的MG及LMG內標混合液，放置10 min，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm，50 mm×2.1 mm);柱溫:35℃;樣品室溫度:10℃;流動相A:含0.1%甲酸的5 mmol/L的乙酸銨水溶液;流動相B:0.1%甲酸乙腈溶液;進樣體積:10 μL;流速:0.30 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min，40%B;1.0～3.0 min，40%～95%B;3.0～5.0 min，95%～40%B。

1.5 質譜條件

電離方式:ESI(+);電離電壓:2.5 kV;錐孔電壓:45 V;離子源溫度:110℃;錐孔反吹氣流量:50 L/h;脫溶劑氣溫度:380℃;脫溶劑氣流量:550 L/h;采集方式:多反應監測(MRM);定性、定量離子對見表1。

表1 目標化合物的MRM監測離子對及其質譜參數Table 1 Mass spectrometric conditions for monitoring of target compounds

1.6 前處理方法

水樣:預先用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL檸檬酸緩沖溶液(pH 2.6)活化Waters Oasis MCX(150 mg，6 mL)SPE柱，然后將“1.3”制備的水樣過柱。依次用3 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液、5 mL水、5 mL 50%甲醇水溶液、3 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液。真空抽干后，用5 mL乙酸乙酯－甲醇－氨水(50∶45∶5)混合溶液進行洗脫，收集于10 mL離心管中，于45℃下氮氣吹干。殘留物加入1.0 mL的乙腈－5 mmol/L乙酸銨溶液(80∶20)，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機相濾膜后，上機檢測。

底泥樣品:準確稱取(5.0±0.05)g底泥樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入15 mL乙腈，旋渦2 min，超聲萃取20 min后靜置30 min;再向離心管中加入10 mL二氯甲烷，旋渦2 min后，4 000 r/min離心5 min，取下層清液于旋轉蒸發瓶;再次向離心管中加入10 mL乙腈－二氯甲烷混合液(3∶2)，重復上述操作，合并萃取液，于45℃旋轉蒸干;殘余物加入1.0 mL的乙腈－5 mmol/L乙酸銨溶液(80∶20)，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機相濾膜后，上機檢測。

2 結果與討論

2.1 液相色譜及質譜條件的優化

MG及其代謝物LMG屬于三苯基甲烷類化合物，具有弱堿性，因此可以通過調節流動相的pH值來抑制弱堿的解離，同時加入甲酸和乙酸銨有利于目標分析物的分子離子化，并改善峰形。采用梯度洗脫有利于將目標分析物和基質分開，并有利于提高離子化效果。在已有文獻的研究基礎上［17－18，21］，通過優化得到的液相洗脫條件如“1.4”所示。根據MG和LMG的化學性質，選擇ESI正離子模式。用流動注射進樣方式對MG、LMG及其對應內標物質的母離子進行掃描，得到其準分子離子峰，再以適當的碰撞能量對準分子離子進行子離子掃描，響應值最強的子離子作為定量離子，響應值相對較強的離子作為定性離子。以MRM掃描模式對母離子與子離子進行碎裂電壓及碰撞能量的優化，優化后的參數見表1。采用優化后的色譜條件和質譜條件，MG和LMG及其對應內標的標準溶液質量色譜圖如圖1所示。

圖1 MG、LMG及其對應內標標準品溶液(2.0 μg/L)的 MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of MG，LMG ，MG-D5，LMG-D6at 2.0 μg/L standard solution

2.2 水溶液萃取固相萃取柱的選擇

水體中MG和LMG含量一般較低，因此需對樣品進行提取、富集和凈化?，F有方法中，生物基質多采用氧化鋁柱凈化，但水體極性較大，氧化鋁對目標化合物有一定的吸附造成目標化合物回收率偏低。因此，本文比較了Oasis MCX、Oasis WCX和AccuBOND SCX 3種陽離子交換固相萃取柱對水體中MG和LMG的凈化效果，發現MCX柱對這2種化合物的保留效果較好(見表2)。WCX柱對 MG保留較差，回收率低，對LMG保留較好;而SCX柱的效果則相反。這可能是因為Oasis MCX柱具有反相與陽離子交換雙重機理，其選擇性更強，效果更好，因此本研究選用Oasis MCX柱進行樣品凈化處理?？紤]到水環境中MG及其代謝物的濃度一般較小，按照最大吸附量是填料的二十分之一來計算，選擇150 mg/6 mL規格的固相萃取柱已滿足分析方法的要求。

表2 WCX、MCX和SCX固相萃取柱對回收率的影響Table 2 Influence of WCX，MCX and SCX SPE on recoveries of MG and LMG

2.3 固相萃取條件的優化

陽離子交換柱適合堿性化合物的富集和凈化，因此一般采用酸性溶液活化，堿性溶液洗脫。本實驗在甲醇和水活化的基礎上，選用pH 2.6的檸檬酸緩沖溶液繼續活化，可保持填料對陽離子和非極性分子的吸附活性，同時使目標分析物保持正離子態而被吸附保留在柱上，從而提高填料對目標分析物的吸附活性。由于需要堿性有機溶液才能使填料失活解吸，因此可以選擇用酸性或中性溶液淋洗萃取柱，洗去極性大和極性較小的共存有機干擾物質，最后用堿性溶液洗脫。本實驗按照極性逐漸減小的順序，依次用0.1 mol/L的鹽酸溶液、水、50%甲醇水溶液、3 mL正己烷淋洗，以去除吸附在填料上的大部分基質干擾。同時考察了甲醇－氨水(95∶5)、乙腈－氨水(95∶5)、乙酸乙酯－甲醇－氨水(50∶45∶5)3種洗脫液的洗脫效果。結果表明，在同等體積下，乙酸乙酯－甲醇－氨水(50∶45∶5)的洗脫效果最好，回收率最高，因此選擇其為洗脫溶液。將500 mL 5.0 μg/L的水溶液按照“1.6”方法過柱后，持續加入12 mL洗脫液，分別用過濾管收集流出液，每2 mL收集1管。45℃下氮氣吹干后，殘余物加入1.0 mL乙腈－5 mmol/L的乙酸銨溶液(80∶20)，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機相濾膜后，上機檢測。發現8 mL以后的洗脫液中，均檢測不到目標分析物，說明8 mL洗脫液可將目標物完全洗脫。為保證洗脫完全，在實際應用時采用10 mL洗脫液進行洗脫。濃縮富集前加入MG-D5和LMG-D6內標，結果顯示方法的回收率、穩定性和重現性均較好。

2.4 底泥樣品中濃縮富集條件的優化

底泥樣品均質稱量后，需加入一定量的TMPD溶液作為抗氧化劑來提高樣品中MG和LMG的回收率。對固體樣品中MG和LMG的提取，常用的提取溶劑包括乙腈、甲醇、乙酸銨緩沖液和二氯甲烷等［18－23］。常用的方法是先加入乙腈，使底泥中的目標分析物溶解到乙腈溶液中，然后用二氯甲烷將乙腈中的MG和LMG反萃取到二氯甲烷溶液中，最后將二氯甲烷提取液進一步濃縮和凈化。本實驗考察了乙腈和二氯甲烷的體積比分別為2∶3、1∶1和3∶2時的提取效果，回收率結果如表3所示。結果表明，乙腈與二氯甲烷采用3∶2比例時，回收率最高，穩定性較好，因此選擇乙腈和二氯甲烷體積比為3∶2的混合液為提取液。以有機試劑對固體粉碎樣品進行提取時，一般采用有機試劑的體積為固體樣品質量的5倍左右，以使提取液和樣品表面充分接觸而提高提取效果，因此選擇加入25 mL提取液，即先加入15 mL乙腈，渦旋和超聲提取后，再加入10 mL二氯甲烷渦旋和離心。再次向離心管中加入10 mL乙腈－二氯甲烷混合液提取液，重復提取一次，合并萃取液，于45℃旋轉蒸干，可使回收率達到80%以上。

表3 不同乙腈和二氯甲烷體積比對回收率的影響Table 3 Influence of different volume ratio of HCN to DCM on recoveries of MG and LMG

2.5 方法的標準曲線與靈敏度

在優化條件下，分別采用內標法和外標法考察了MG和LMG的線性范圍(見表4)，結果顯示兩者質量濃度均在0.2～100 μg/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r2大于0.995。但采用外標法對實際樣品進行定量時，MG和LMG在環境水和底泥樣品中的回收率分別在45%和60%左右，這可能是基質效應造成的結果。而采用內標法定量時，回收率分別在80%和90%左右，大大減少了基質效應帶來的影響，因此本方法采用內標法定量。

表4 MG和LMG的回歸方程及相關系數(r2)Table 4 Regression equation and correlation coefficients(r2)of MG and LMG

采用向陰性樣品中添加標準物質的方法，進一步考察方法的靈敏度。在方法規定的取樣體積和定容體積下，按3倍信噪比計算得該方法在環境水樣和底泥樣品中的檢出限(LOD)分別為0.2 ng/L和0.02 μg/kg，以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)分別為0.4 ng/L和0.04 μg/kg。

2.6 方法的回收率與精密度

采用空白加標的方式，在環境水樣中分別添加1.0、10.0、100 ng/L 3個濃度梯度，底泥中MG和LMG分別添加0.20、2.00、20.0 μg/kg，按照本方法處理后測定，回收率和相對標準偏差見表5。

表5 養殖環境水和底泥中MG和LMG的加標回收率及相對標準偏差Table 5 Spiked recoveries and RSDs of MG and LMG in negative water and sediment in aquatic environment

由表5可見，在養殖環境水體中，MG和LMG的平均回收率為77%～90%，RSD為7.2%～11.4%;底泥中MG和LMG的平均回收率為82%～91%，RSD為6.3%～11.6%。因此，MG和LMG在水產養殖環境水和底泥中的加標回收率均能達到檢測要求，說明本方法具有較高的準確性。同時，RSD均低于15%，表明結果在置信區間內，本方法具有較高的可靠性。

2.7 實際樣品的測定

采用該方法測定了東北地區11家水產養殖場的養殖池塘水體和底泥中MG和LMG的殘留情況，在3家檢出的養殖場中，其水體中MG的濃度為2.7～11.6 ng/L，LMG的濃度為6.5～21.6 ng/L;底泥中MG的濃度為0.8～18.7 μg/kg，LMG的濃度為2.8～26.4 μg/kg。經進一步調查，發現該3家養殖場在幾年前確曾采用過MG來防治和治療水霉病，因此，該方法可用于水產養殖環境水體和底泥中MG和LMG殘留量的測定。

3 結論

本文通過優化固相萃取條件和液液萃取條件，建立了水產養殖環境水體和底泥中MG和LMG殘留的高靈敏分析和確證方法。結果表明，本方法在0.2～100 μg/L范圍內呈現良好的線性關系，水體和底泥中的檢出限分別為0.2 ng/L和0.02 μg/kg;相對標準偏差(RSD)均小于12%。該方法步驟簡單、回收率高、精密度良好?？勺鳛樗w和底泥中MG及其代謝物LMG殘留的檢測方法，并可為MG及LMG在水產品中的富集規律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，為水產品中MG及LMG溯源和衛生監督提供檢測技術支持。

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