酒曲生物轉化降解河豚毒素的初步研究

賈晉斌，舒靜，彭銳，孫惠川，王文權，崔安雷

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種氨基全羥基喹唑啉化合物，通常以“兩性離子”的形式存在[1]，是豚毒魚類及其他生物體內含有的一種生物堿，也是一種劇毒的非蛋白質天然神經毒素。TTX為毒性極強的生物毒素之一，其毒性比氰化鉀強1250 倍，且無有效的解毒劑[2]。河豚毒素中毒后，潛伏期短、病死率高，吸收后迅速作用于末梢神經和中樞神經系統，使神經傳導障礙，首先感覺神經麻痹，后運動神經麻痹，嚴重的腦干麻痹導致呼吸循環衰竭[3]。

目前國內外對河豚毒素的微生物來源、性質以及河豚魚源的河豚毒素提取和檢測方面研究頗多，但微生物能否降解河豚毒素尚未見報道。在日本石川縣，用河豚卵巢做的米糠浸漬醬菜，是將河豚的卵巢用鹽腌藏以后，再放入米糠中讓其發酵，經過鹽漬一段時間后，河豚魚的卵巢毒性可以降低到一個可供食用的水平[4]。這可能是米糠中的某些微生物作用的結果。而在白酒釀造過程中，酒曲是用高粱、玉米、大米、大麥、糯米、米粉或麩皮等糧食作物作為原料，加入一定量的母曲，在控制溫度和濕度的條件下制成的，其中的微生物主要有霉菌、酵母還有少量的細菌。本研究擬在已建立的離子色譜法定量檢測酒曲發酵液中的河豚毒素[5]的基礎上，以酒曲為基質，利用酒曲發酵液中微生物種群這一生態體系達到轉化降解河豚毒素的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養基 黑曲霉（Aspergillus niger BYK0001008）、青霉（Penicillium BYK0001005）、黑根霉（Rhizopus nigricans BYK0001003）、釀酒酵母（S.cerevisiae BYK00049-01-01）、乳酸菌（Lactobacillus BYK00056-01-01）取自農業部漁業動植物病原庫。PDA 培養基和 MRS 培養基，用0.1 MPa 壓力滅菌 20 min。

1.1.2 儀器、試劑及材料 GSP-9270MBE 隔水式恒溫培養箱為上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；GHP-9050 隔水式恒溫培養箱為上海一恒科技有限公司產品；DL-5-B 型低速離心機為上海安亭科學儀器廠產品。實驗用水為 Millipore Advantage A10 超純水；濃硫酸、磷酸為分析純，購自國藥集團；TTX 標準品（純度 ≥ 99%）購自河北省水產研究所；酒曲為山東黃河龍酒業集團股份有限公司提供。

1.1.3 實驗動物 普通級昆明小鼠，雄性，30 ～32 g，購自上海實驗動物資源中心。

1.2 方法

1.2.1 TTX 溶液的配制 1 mg TTX 標準品溶于10 ml 0.1% 的磷酸溶液中，制成 100 mg/L 的溶液，依次稀釋成 40、60、80、100 mg/L 的 TTX溶液。

1.2.2 配制指示菌懸液 將三種霉菌（黑曲霉、青霉、根霉）制成一定濃度的稀釋液：將 121 ℃ 滅菌 20 min 的無菌水加入到培養有霉菌斜面的試管中，用接種環輕輕刮下孢子，將含有孢子的無菌水轉入三角瓶中，加入玻璃珠，在搖床上打碎，經濾膜過濾后得到單孢子懸液 10 ml。釀酒酵母和乳酸菌[6]分別在 PDA 液體培養基和 MRS 液體培養基中培養 3 d 后，分別用無菌吸管從三角瓶中吸取1 ml 孢子液注入盛有 9 ml 無菌水的試管中，以此類推，制成 10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度的菌懸液。

1.2.3 抑菌實驗方法[7]將 PDA 固體培養基和MRS 固體培養基在高壓滅菌釜中，用 0.1 MPa 壓力滅菌 20 min，并冷卻至 60 ℃ 左右，用吸管準確量取 20 ml，加入內徑一致并預先水平放置的培養皿內，凝固后干燥培養皿中水份，吸取一定濃度的指示菌懸液 0.3 ml 至平板上，用無菌玻耙涂布均勻，涂布后以平板無可見水滴為準，并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養皿中，在水平放置的平皿中均勻地放置 4 只牛津杯。吸取一定濃度的TTX 溶液 0.25 ml 至上述牛津杯中，注意不要將TTX 溶液溢出牛津杯外。將陶瓦蓋蓋在加入 TTX溶液的平皿上，然后將其放置在 35 ℃ 的恒溫培養箱中培養 5 d 后拍照。

1.2.4 轉化條件優化實驗

1.2.4.1 培養時間對轉化速率的影響 稱取 30 g酒曲于三角瓶中，添加 1 ml 上述配制好的 100 mg/L TTX 溶液，攪拌均勻，分別稱重，記錄。置于30 ℃ 恒溫培養箱中培養，每隔 48 h 依次取樣一次，稱重，及時添加去離子水以補充在培養過程中蒸發的水分。在培養過程中，每天早晚都予以攪拌。取好的樣品置于 –18 ℃ 冰箱中保存。

1.2.4.2 酒曲投加量對轉化速率的影響 分別往10、20、30、40、50、60 g 酒曲中添加 1 ml 100 mg/L的 TTX 溶液，攪拌均勻，置于 30 ℃ 恒溫培養箱中靜置培養，48 h 后取樣測發酵液中 TTX 的濃度。TTX 的轉化速率 =（TTX 的初始濃度 － 轉化后 TTX 的濃度）/時間。

1.2.4.3 溫度對轉化速率的影響 將酒曲發酵液中加入 1 ml 100 mg/L 的 TTX 溶液，攪拌均勻，分別置于 20、25、30、35、40 ℃ 恒溫培養箱中恒溫培養，48 h 后取樣測發酵液中 TTX 的濃度。

1.2.4.4 搖床轉速對轉化速率的影響 將酒曲發酵液中加入 1 ml 100 mg/L 的 TTX 溶液，攪拌均勻，靜置，30、50、100、150 r/min 搖床培養箱中30 ℃ 恒溫培養，48 h 后取樣測發酵液中 TTX 的濃度。

1.2.5 小鼠法檢測轉化效果 在上述確定的最佳轉化條件下，用小鼠法[8-9]檢測酒曲發酵液對 TTX的轉化效果。以注射器中樣液全部注入小鼠體內開始計時，以出現河豚毒素中毒的典型癥狀為標準判斷小鼠是否為中毒致死，以小鼠停止呼吸為判斷時間終點的標準。小鼠中毒的典型癥狀是注射后先安靜，隨后急動、轉圈、動作生硬不靈活、大口呼吸、抽搐，最終死亡。

1.2.5.1 樣品處理 稱取 40 g 酒曲于三角瓶中，分別添加 1 ml 100 mg/L 和 10 mg/L 的 TTX 溶液，攪拌均勻，置于 30 ℃，轉速為 50 r/min 的培養箱中搖床培養，每隔 48 h 取樣一次，分別標號。樣品中加 0.1% 磷酸乙腈溶液，5000 r/min 離心10 min，取上清液，50 ℃ 減壓蒸餾除去乙腈，用0.1% 的磷酸溶液溶解定容至 1 ml。

1.2.5.2 小鼠法檢測條件 把 TTX 標準品用乙酸溶解為 1 mg/L，不斷稀釋，取 0.3 ml 腹腔注射小鼠，至小鼠死亡時間接近 30 min，當稀釋至濃度為 0.1 mg/L 的 TTX 標準品溶液注射小鼠時，小鼠未死亡。樣品中的 TTX 提取出來后，取 0.3 ml注射小鼠，每個樣重復 3 次，取平均死亡時間。

2 結果

2.1 抑菌實驗確定 TTX 初始濃度

從圖 1 中可以看出，對于各種稀釋度的指示菌懸液，在 4 種濃度的 TTX 溶液作用下，均無明顯抑菌圈出現，說明 100 mg/L 以內的 TTX 濃度對酒曲中的微生物沒有影響。

2.2 條件優化

2.2.1 培養時間的影響 利用離子檢測方法對每隔 48 h 取樣酒曲樣品進行測定，發現經過一段時間，河豚毒素的含量發生了很大變化，圖 2 為添加到酒曲發酵液中的 TTX 含量隨培養時間變化的趨勢圖。

由圖 2 可見，隨著時間的增加，酒曲的毒素轉化率也隨之增加，當培養時間為 6 d 時，酒曲的毒素轉化率最高，毒素轉化率達到 80% 以上，隨著培養時間的繼續增加，酒曲中開始出現雜菌生長，且有不良氣味散出，不宜再繼續轉化實驗。

圖1 不同濃度的 TTX 溶液對幾種微生物的抑菌效果Figure1 Antibacterial activity of different concentrations of TTX solution to several microorganisms

圖2 酒曲中 TTX 含量隨時間變化趨勢Figure2 Trends over time of TTX content in distiller's yeast

2.2.2 酒曲投加量的影響 由圖 3 可以看出，隨著酒曲投加量的增加，TTX 的轉化速率也隨之增加，直到投加量為 40 g 時 TTX 的轉化速率最高，轉化率達到了 76.8%，當投加量超過 40 g 時，酒曲對 TTX 的轉化速率基本維持不變。

2.2.3 培養溫度的影響 不同溫度下，培養 2 d后酒曲在 30～35 ℃ 對 TTX 的降解效果最為顯著，達到 90% 以上（圖 4）。

2.2.4 搖床轉速的影響 在實驗中，由于酒曲是半固體狀態，采用搖床振蕩培養來考察通氣量對TTX 轉化速率的影響。結果（圖 5）表明，一定的通氣量對 TTX 的轉化有一定促進作用。靜置培養或搖床轉速過大均不利于酒曲對 TTX 的轉化。當轉速達 50 r/min 時可獲得最佳的轉化效果。

圖3 不同酒曲投加量對 TTX 轉化速率的影響Figure3 Influence of different distiller's yeast dosage to TTX transformation rate

圖4 不同溫度下對 TTX 轉化速率的影響Figure4 Influence of different temperature to TTX transformation rate

圖5 不同搖床轉速對 TTX 轉化速率的影響Figure5 Influence of different shaker rotate speed to TTX transformation rate

2.3 小鼠法檢測結果

小鼠生物法檢測 TTX 轉化效果如表 1 所示。

由于添加到酒曲中的 TTX 初始濃度很大，為100 mg/L，小鼠被注射后在很短的時間內死亡，表明酒曲中的河豚毒素濃度很大，未能將其降到安全濃度以下。TTX 初始濃度為 10 mg/L時，與第 2 天相比，第 6 天的小鼠死亡時間已由 1.5 min 延長為 20 min，雖然對小鼠的毒性仍較大，但可以看到酒曲對 TTX 的轉化有明顯效果。

表1 小鼠生物法測定酒曲對 TTX 轉化效果Table1 Effect of distiller's yeast on TTX transformation by mouse bioassay

3 討論

由于自然界河豚魚含毒各器官中 TTX 平均濃度約為 100 mg/L。進行抑菌試驗的目的是為了檢測在自然界河豚魚器官中平均濃度的 TTX 溶液對酒曲中的微生物的生長抑制作用及程度，以此來判斷酒曲中添加 TTX 的濃度。

酒曲對河豚毒素的轉化實驗結果表明，經過一段時間的作用，添加到酒曲中的 TTX 含量在減少，酒曲對河豚毒素確實有一定的轉化降解作用。對影響轉化降解的因素，如時間、酒曲投加量、溫度、搖床轉速等進行了初步探索，找出了最佳的轉化降解條件。生物轉化過程中，微生物量對于 TTX的轉化時間有著重要的指導意義。本實驗中，微生物濃度越低，達到一定處理效果所需時間越長，而微生物濃度過高，由于受到包括溶氧量等其他條件的限制，化合物轉化速率不再上升。且溫度對微生物具有廣泛的影響，總體上說，微生物的全部轉化過程都取決于化學反應，反應速率都受溫度的影響，在最適生長溫度范圍內，反應溫度升高，平均轉化速率隨之增加，但超過一定限度，會使酶失活速率也加快。

有關轉化機理以及 TTX 被轉化為何種物質，有待于進一步研究確定。微生物轉化的本質是某種微生物將一種物質（底物）轉化成為另一種物質（產物）的過程，是通過微生物細胞將復雜的底物進行結構修飾，也就是利用微生物代謝過程產生的某個或某一系列的酶對底物特定基團進行的催化反應[10]。一般的微生物對有機化合物的轉化模式，主要有以下幾種：脫氫反應（主要是細菌）、羥基化反應（主要是放線菌）、水解反應（主要是細菌、霉菌、酵母菌）、還原反應（主要是酵母菌和霉菌）、?；磻ㄖ饕羌毦?、降解反應（主要是細菌）、脫水反應（主要是細菌和霉菌）等。河豚毒素有多種衍生物：脫水河豚毒素、河豚酸、4-表河豚毒素、6-表河豚毒素、4-表-11-脫氧河豚毒素、4,9-脫水-6-表河豚毒素、11-Nor-河豚毒素-6 (R)-ol、11-脫水河豚毒素和 5-脫氧河豚毒素等[11]，但毒性都沒有河豚毒素那么強。無毒的河豚魚體內含有河豚毒素衍生物，其對小鼠沒有致死性，表明該河豚魚是以無毒的河豚毒素衍生物作為前體或代謝產物[12]。

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