大規模間充質干細胞培養技術評估報告

陳津，郭子寬，王立生，崔春萍，胡澤斌，吳朝暉，吳祖澤

20 世紀 70年代，人們發現了一種來源于中胚層、成纖維樣貼壁生長的細胞，后來確定為間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）[1-2]。MSC 是一群具有高度自我更新能力和分化潛能的成體干細胞。因其具有免疫調控、分泌細胞因子、取材方便等優點而倍受關注，成為細胞治療的理想種子細胞[3]。間充質干細胞研究日益受到廣泛關注并顯示出越來越廣闊的應用前景，在細胞治療、組織工程等領域具有極為重要的應用價值，是繼造血干細胞之后臨床應用研究最多，也是最成熟的一種成體干細胞。

1995年首次報道 MSC 應用于臨床實驗，現在培養的 MSC 已被廣泛地用于臨床實驗研究，如移植物抗宿主?。℅VHD）、充血性心力衰竭、急性心肌梗死、2 型糖尿病、脊髓損傷、軟骨和骨損傷、克羅恩病等，而且在腎臟、肌肉和肺的損傷修復中也有初步進展[3]。雖然成體干細胞在許多疾病的臨床研究中表現出令人振奮的療效，但迄今為止，除了造血干細胞用于治療血液系統惡性腫瘤外，尚未有其他成熟的成體干細胞作為常規的治療方法進入臨床實踐。其中涉及的問題很多，包括干細胞療法進入臨床實踐的政策法規保障、用來驗證干細胞療法安全性與有效性的合適的動物模型、臨床治療的評價方法與體系尚未完善、干細胞產品臨床應用的技術標準及規范尚未健全以及相關的倫理學論證等。同時，MSC 培養工藝從實驗研究模式轉向大規模生產臨床級的 MSC 還需要根據臨床應用的要求，對培養技術各方面進行深層次的評估。本報告主要對大規模培養間充質干細胞的技術做一評估。通過對間充質干細胞體外培養技術的系統評價，為制定間充質干細胞臨床研究管理規定提供相關信息，為細胞治療準入制度的建立提供方法學依據。主要明確間充質干細胞的來源、分離方法、培養體系、保存、安全性、質量標準及質量監控評估等問題。

1 資料與方法

1.1 資料來源

① PubMed 數據庫、EMBASE 和 MEDLIN數據庫以主題詞或關鍵詞檢索間充質干細胞（mesenchymal stromal cells）和細胞培養技術（cell culture techniques），限制研究對象為人類（human），文獻檢索時間不限，再根據不同的技術方法的主題詞或關鍵詞分別二次檢索細胞來源（mesenchymal stem cell sources），無血清培養基（serum free medium），培養過程（culture processes, good manufacturing practices），細胞凍存技術（cryopreservation），基因組不穩定性（genome instability），腫瘤形成（tumor formation），質量控制（quality control），臨床研究（clinical trial，clinical grade 和 clinical use）等。根據檢索結果分類評估，根據問題和摘要逐一進行人工篩選。②廣泛收集有關網站（如 NIH 臨床試驗登記網站 http://www.clinicaltrial.gov/、FDA 網站 http://www.fda.gov/ 和國際細胞治療協會網站 http://www.isscr.org/ 等）的相關內容。③其他國家和地區有關的細胞治療管理法案和技術報告。

1.2 納入標準

⑴以間充質干細胞研究為對象；

⑵涉及細胞培養技術方面；

⑶涉及評估目標內容；

⑷以臨床研究為目的；

⑸細胞治療管理規定。

1.3 排除標準

⑴研究對象為動物；

⑵文獻不含培養技術相關內容；

⑶其他干細胞研究內容；

⑷以基礎研究為主；

⑸不含評估目標內容。

1.4 專家討論

形成初步評估報告后，由衛生計生委科教司和中國醫藥生物技術協會組織相關專家進行討論分析，形成評估報告和建議。

2 評估結果

2.1 MSC 的來源

MSC 可以來源于骨髓、脂肪、臍帶、臍帶血、胎盤、蛻膜、羊膜、羊水、皮膚、肌肉、牙髓、血管、滑液、心臟、脾、腎周脂肪、胚胎組織或胚胎干細胞、腸上皮組織、經動員的外周血等眾多組織[2, 4-25]。

⑴骨髓間充質干細胞：骨髓一直是 MSC 的主要來源，成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）分析揭示，骨髓中 MSC 的量大約占單個核細胞數的萬分之一到百萬分之一。骨髓間充質干細胞（BMSC）是目前研究較為深入的一類成體干細胞。BMSC 易于外源基因的轉染和表達，是細胞治療、組織器官缺損修復及基因治療的理想種子細胞。目前在 NIH 登記的骨髓 MSC 臨床試驗有 144 項，PubMed 上已發表的人骨髓 MSC 臨床試驗文章有 91 篇。

⑵臍帶血間充質干細胞：臍帶血是間充質干細胞的一個潛在的來源，Erices 等[26]在 2000年就報道了臍帶血來源的單個核細胞中包含具有 MSC特征性表面抗原的細胞，并具有多向分化能力。與骨髓相比，MSC 在臍血中的比例更低，大約每 105～ 108個單個核細胞含有 1 個。但是由于臍帶血庫等網絡的存在，臍帶血有更為充足的來源，而且臍血的免疫原性較弱，不易發生免疫排斥反應，臍血受胎盤屏障的保護，其成分被病毒、細菌污染的概率低，有利于臨床的實際應用等優點，使得臍帶血有可能成為生產臨床級 MSC 的來源。事實上，早有以臍血成功治療 HLA配型不完全匹配的惡性血液病和免疫缺陷病的報道[27]。目前在 NIH 登記的臍帶血來源 MSC 臨床試驗有 10 項。

⑶臍帶間充質干細胞：Covas 等[28]和 Romanov等[29]分別從臍靜脈內皮和內皮下分離出一種成纖維樣細胞，可分化為脂肪細胞和成骨細胞。同年，Mitchell 等[30]從臍帶 Wharton’s jelly 中分離出間充質干細胞。臍帶 MSC 表達基質細胞衍生因子-1（SDF-1）和血管內皮生長因子（VEGF），提示其具有治療心腦梗死、脊髓損傷的可能。與骨髓 MSC相比，臍帶 MSC 的 CFU-F 數、增殖能力和神經細胞誘導分化能力均高于骨髓 MSC，HLA-I 和CD106 分子表達低于骨髓 MSC，使它成為更理想的細胞治療的種子細胞。目前在 NIH 登記的臍帶來源 MSC 臨床試驗有 53 項。

⑷脂肪間充質干細胞：2001年，Zuk 等[31]首次從人脂肪組織中分離出一種多向分化干細胞，因其與骨髓間充質干細胞形態相似而稱為脂肪間充質干細胞（ASC）。此后幾個研究小組也先后采用相似的分離方法分別從脂肪組織中分離得到ASC。近年來許多研究表明，脂肪干細胞具有向脂肪、骨、軟骨、肌肉、內皮、造血、肝、胰島和神經等多種細胞方向分化的多分化潛能[6-7,25]。ASC和 BMSC 均表達 CD13、CD29、CIM4、CD105，均不表達 CD31、CD34、CINS、HLA-DR。脂肪干細胞作為一種來源廣泛的自體干細胞有著不可比擬的優勢。目前在 NIH 登記的脂肪來源 MSC 臨床試驗有 30 項。

⑸胎盤間充質干細胞：Zhang 等[32]首次從胎盤灌流液中培養出 MSC，并從生物學特征和功能等方面進行了系統研究。Fukuchi 等[33]從成熟胎盤小葉中得到間充質干/祖細胞，可表達數種干細胞標志性基因及組織特異性基因。后來學者陸續從人成熟胎盤的羊膜、絨毛膜、胎盤小葉、底蛻膜和壁蛻膜分離培養出間充質干細胞，且 RT-PCR 分析胎盤來源的間充質干細胞表達中胚層、外胚層和內胚層的相關基因。體外培養的胎盤間充質干/祖細胞具有多向分化潛能及造血支持和免疫抑制效應，其擴增能力優于成人骨髓 MSC。胎盤來源豐富、取材方便，MSC 易于分離，是 MSC 又一新來源。目前在NIH 登記的胎盤來源 MSC 臨床試驗有 7 項。

⑹羊水間充質干細胞：羊水與胎兒直接接觸，除胎兒表皮、體腔管道等處的脫落細胞外，羊水中還可能存在來源于胎盤或桑葚胚的內細胞群的原始細胞[34]。1993年，Torricelli等[35]首次報道孕 12周之前羊水中有造血祖細胞，它可能來源于胚胎期卵黃囊。1996年，Streubel等[36]發現羊水中存在向成肌細胞轉化的羊水細胞，可能為具有多向分化潛能的非造血祖細胞。 最近，In't Anker 等[37]證實孕中期（17～22 周）羊水中能夠分離培養出胎兒MSC，但孕晚期（平均 38+ 周）羊水分離胎兒 MSC的成功率僅為 20%。目前的研究均采用超聲引導下羊水穿刺技術在臨床妊娠中期婦女做產前診斷時抽取少量羊水提取胎兒 MSC，這種操作技術雖已成熟，但取材過程中仍可能對胎兒和母體造成傷害，甚至引起流產、宮內感染等并發癥。

⑺其他組織來源間充質干細胞：研究者還分別從分血管大隱靜脈壁[28]、骨組織、骨骼肌、軟骨及胎兒肺臟、胰臟、肝臟、腎臟來源的貼壁細胞和胎兒的真皮、腸上皮組織中成功分離出間充質干細胞。還有研究者使用胚胎干細胞分化成間充質干細胞。但是這些組織并沒有穩定的來源，或者從倫理上并不適合作為臨床大規模生產 MSC 的組織來源。Kassis 等[24]還從 G-CSF 動員的外周血中分離出 MSC。雖然有些報道稱在外周血中檢測到具有MSC 特征的細胞，但是通常 MSC 是不存在于正常供者的外周血中的[38-40]。

2.2 間充質干細胞分離純化技術

不同組織來源的 MSC 分離方法不同，歸納起來主要可以分為兩大類：①骨髓、臍帶血、羊水來源的 MSC 以單個細胞存在于細胞群中，采用全骨髓法或全血直接培養方法，以及密度梯度離心分離、免疫磁珠或流式細胞分選的方式進行分離，利用 MSC 貼壁生長的特性進行純化。如利用STRO-1 進行流式細胞分選可以獲得 950 倍富集的 CFU-Fs[41]，其他細胞抗原如 a1-integrin subunit（CD49a）或 CD271（LNGFR）可以被用來富集骨髓單個核細胞[42-43]，但是這些方法富集的 MSC還沒有達到完全純化。而且許多抗體作為實驗研究篩選使用，還需要發展臨床級富集分選 MSC的抗體。②臍帶、胎盤、羊膜、脂肪來源的 MSC 存在于組織中，需要用膠原酶、胰酶、透明質酸酶等消化分離成單個細胞后，再進行分離純化，也可采用組織塊法，利用 MSC 具有遷移能力的特性獲得直接貼壁的 MSC。

2.3 MSC 體外培養技術

不管是來源于骨髓還是其他組織的間充質干細胞原始數量都是很有限的，要達到臨床應用的細胞數量級，就必須經過體外的擴增培養。因此間充質干細胞體外擴增培養技術是 MSC 臨床應用技術的關鍵。主要包括以下幾個方面：

2.3.1 培養方式（培養體系）的選擇 MSC 具有貼壁生長的特性，貼壁生長細胞常采取兩種大規模的培養方法：①傳統的平面培養方式：即保持相同細胞密度的前提下只是簡單地增加細胞的培養體積。通過采用培養瓶或培養皿進行培養，為了培養大量的細胞，需要很大的表面積，因此需要大量的培養瓶和培養空間。Nunc 和 Coring 等公司生產了大的、多層的培養系統（1～10 層或者更多），可以疊加在培養箱中。這些培養瓶近似于一個封閉的系統，大大減少了培養瓶的使用數量，降低了被微生物污染的風險[44]。傳統的培養方式簡便易行，但是也容易污染，所以必須在符合 GMP 的潔凈實驗室內進行。②生物反應器3D 培養方式[44-51]：在生物反應器里培養 MSC 的優勢包括相同體積下培養的表面積比較大、封閉的系統以及種植和收獲的自動化[52]。這些技術能夠為符合 GMP 條件下生產臨床級 MSC 提供可選工具[3,53]。為了實現全封閉培養，減少細胞污染的幾率，一些公司推出了細胞體外培養工作平臺，如美國 Biospherix 干細胞工作站（stem cell workstation），引進低氧培養和低氧操作環境，適用于干細胞體外培養及臨床移植前的干細胞樣品的制備。工作站完全密閉不受外界干擾，杜絕由于實驗員操作不當引起的細胞污染。不足之處就是這樣的系統成本昂貴。

2.3.2 培養基的選擇 培養基是 MSC 培養效率和安全的關鍵。選擇使用的培養基需要能夠維持MSC 在經過數次傳代培養后的表型、功能和基因穩定，因此必須采用優化的培養條件。目前主要用于培養 MSC 的培養基有以下幾種：

⑴含胎牛血清（FBS）的培養基：胎牛血清含有豐富的細胞生長因子、營養等物質。經典的 MSC培養條件就是基礎培養基添加 FBS，但是 FBS 活性具有明顯的批次間差異，而且在培養過程中，MSC 胞漿蛋白中可能殘留 FBS，由此可能會導致患者過敏反應，以及可能引起如瘋牛?。˙SE）、克雅?。–reutzfeldt-Jakob disease）等疾病[54]。FDA 管理規范關于 GMP 生產細胞并沒有絕對禁止使用FBS，但需要有安全證明（TSA）確保沒有傳染病傳播的危險。也有一些權威的管理機構，如德國的PEI，就禁止使用 FBS。此外，從使用 MSC 的安全性角度要求有更安全的產品替代 FBS[55]，如人源的血清或成分確定的無血清培養基[56]。

⑵不含動物血清的培養基：許多研究者采用人源產品，如輸血安全級的人 AB 血清或血小板裂解物來替代動物血清。這些產品來自于輸血中心，可確保微生物的安全。經許多研究小組證明，使用血小板裂解物可以有效地替代 FBS[54-56]，很多臨床研究單位也倡議使用血小板裂解物來實現臨床級間充質干細胞的擴增培養[57]。

⑶成分確定的無血清培養基[4,11,58-76]：無血清培養基（serum free medium，SFM）就是不需要添加血清，通過像雞尾酒式的添加生長因子（如FGF2、PDGF、TGF-β）就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖，能夠維持培養的 MSC 主要的表型和功能特征[66]，但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。MSC 是貼壁生長細胞，無血清、無蛋白培養基缺乏血清中的各種黏附貼壁因子如纖連蛋白、層黏連蛋白等，因此需要添加這些組分以保證細胞貼壁。這就要求這些添加的蛋白需要在避免基因污染條件下生產。目前市場上的無血清培養基主要由幾家國外大公司生產，其中一家已獲得FDA 批準應用與臨床研究（表 1）。然而事實上，目前的無血清培養基并不向商業公司說的那么好。許多研究證明了用含血清的培養基培養的 MSC不發生變異，但是對無血清培養基培養的 MSC 還需要進行相似的安全性研究，判斷無血清培養基對MSC 基因穩定性的影響是否會導致腫瘤的形成。雖然理想的 MSC 培養基還沒有形成共識，但無血清培養基是臨床級間充質干細胞培養的最終方向。

2.4 細胞凍存技術

細胞凍存技術是間充質干細胞臨床應用中很關鍵的技術。分離和生產的大量不同組織來源的MSC 需要可靠的長期保存方法，以備將來臨床應用[77-87]。

2.4.1 凍存保護劑 凍存保護劑是深低溫保存組織細胞不可缺少的部分。目前常用的低溫保護劑有二甲基亞砜（DMSO）、甘油、糖類、羥乙基淀粉等。低溫保護劑二甲基亞砜的濃度，以 10%（v/v）保存效果較佳；甘油則以 10%～15%（v/v）濃度為好。復蘇后低溫保護劑必須進行洗滌，從細胞懸液中清除，以降低低溫保護劑的毒性影響。幾種低溫保護劑混合使用可減輕毒性，提高細胞存活率。如保護劑 CP-1 的主要成分為 DMSO 和羥乙基淀粉，這兩種不同性質的冷凍保護劑聯合應用，共同發揮作用，冷凍保護效果優于單獨應用其中任何一種。

表1 市場上主要的無血清培養基

2.4.2 細胞凍存方式 干細胞的冷凍最好采用程控降溫儀進行。利用程控降溫儀嚴格控制降溫速度（1～3）℃/min，經過相變（–11～–15 ℃）熱釋放之后加快降溫速度，降至 –80 ℃ 或 –90 ℃，再轉入液氮中（–196 ℃） 長期保存。有些研究者用乙二醇、丙二醇和蔗糖作為基礎的細胞凍存保護劑來替代 DMSO，用聚乙烯醇作為輔料建立的直接放入液氮的玻璃化凍存方式實現了較好的細胞保存效果。

大量研究證明，保存的 MSC 并不改變 MSC的生物學特性，如分化、生長和表面標志物。在臨床使用中最主要的問題是凍存保護劑的毒性，但DMSO 的毒性也可能被過度地評估，因為凍存的MSC 在臨床使用前需要進行稀釋，從而會減輕其毒性。

2.5 大規模培養 MSC 的安全性

間充質干細胞雖然在許多組織中都存在，但是其豐度都極低。因此，體外培養是完成細胞治療必需的步驟。然而，與新鮮分離的間充質干細胞不同，細胞經體外培養擴增后，其生物學特性可能發生很大的變化。從培養體系的安全性來講，間充質干細胞在體外培養過程中，與培養皿、分離液、血清、細胞因子等開放接觸，易于受到熱原和內毒素的污染，有造成受者醫源性感染等不良反應的風險[88]。

2.5.1 基因穩定性[89-110]人體組織中原始 MSC含量很少，但是經過體外長期培養后可以擴增到很大的數量級?？梢詾榕R床應用提供大量的 MSC。通常，成人骨髓 MSC 可以穩定培養 6～10 代，而胎盤臍帶 MSC 可以傳 30～40 代。經過高分辨技術分析體外擴增的人骨髓 MSC，并沒有發現DNA 復制數的畸變。但是在 MSC 長期培養過程中，發現與衰老相關的 CpG 位點發生修飾改變。研究者對不同供者來源的 MSC 的核型分析的結果表明，一般 10 代以內的 MSC 核型比較穩定，未發現變異情況。超過 10 代的細胞，核型發生變異，成瘤性風險增大。人間充質干細胞體外培養連續傳代超過 20 次后，雖然細胞不具備裸鼠致瘤性，但其原癌基因和抑癌基因表達特征與 Ewing肉瘤相似。即使早期和晚期代數的 MSC 在基因組學上沒有差異，也不能說明經過長期培養后基因組沒有發生突變。突變的 MSC 可能不能存活或者因為正常 MSC 的優勢生長，使得突變的 MSC 在長期培養過程中檢測不出來。相反，如果突變的 MSC具有優勢生長或者耐受衰老，那么對于臨床應用更具有風險。

2.5.2 腫瘤形成[57,88,111-115]干細胞具有一些腫瘤細胞的特征，如能夠長期的自我復制，壽命周期長，凋亡耐受等。此外，兩者的生長調控機制很相似，因此干細胞可能惡性轉化，這是使用干細胞藥物產品安全性的主要擔憂之一。一些研究報道通過轉染端粒酶的MSC 可以在體外發生惡性轉化[116]，然而，現在還沒有實質證據證明常規體外擴增的MSC 具有致瘤性。NOD 小鼠體內毒性實驗證明，MSC 在體內沒有形成腫瘤。短尾猴的體內毒性實驗進一步證明輸注 MSC 后，短尾猴體內各項指標并沒有發現改變。細胞毒性結果顯示，MSC 并不影響試驗猴的身體各項指標。Centeno 等[57,111]從2006年到 2010年，總共進行了 339 例患者的實驗，MRI 檢測并沒有發現新生瘤的形成，隨訪至今是安全的。此外，許多 MSC 的臨床研究報告也未報告安全問題。雖然 MSC 在培養過程中是否會誘導細胞的轉化還不確定，但還是存在 MSC 在長期培養過程中發生突變的可能。因此必須在臨床研究中應用 SNP 等分析手段來評價基因組的完整性。從 MSC 的增殖及分化、病毒學檢測、核型分析、STR、HLA 等多個方面系統考察體外擴增過程中MSC 生物學特性和遺傳學特性。

2.6 MSC 的質量監控

臨床使用 MSC 的安全性直接與整個過程的質量控制相聯系。生產安全的細胞產品要求對整個過程進行監管，確保培養細胞的基因型和功能性，確保培養的細胞未分化和無微生物的污染。在MSC 擴增培養過程中面臨著許多風險，如細菌污染、細胞變異、衰老等。

2.6.1 間充質干細胞的標準 間充質干細胞能表達多種表面抗原但不特異，這些表面抗原也可在基質細胞、內皮細胞和表皮細胞出現，但不表達造血干細胞標志物?，F已發現的表面抗原表達陽性的有CD29、CD44、CD59、CD71、SH2、CD73、CD105、CD106、CD166、CD271 等，而 HSC 表面標志CD3、CD14、CD34、CD38、CD45、CD56、CD117、人白細胞抗原（HLA-DR）表達均為陰性。不同研究者選用不同的組合來鑒定，各研究結果之間很難相互比較[117]。為了解決這個問題，國際細胞治療協會提出了一個鑒定 MSC 的最低標準[118]：首先，MSC 必須是貼壁生長的；其次，MSC 必須表達CD105、CD73 和 CD90，同時不表達 CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α/CD19 以及 HLA-DR；第三，在體外 MSC 必須能夠分化成骨、脂肪和軟骨。

2.6.2 間充質干細胞的質量監控[3,53,57,119-130]MSC質量監控包括生產環境的細菌和真菌的檢測，藥品化生產 MSC 的環境要求每 2 周至少進行一次無菌的檢測[131]。收獲細胞質量控制必須確保含有足夠量的干/祖細胞，能夠達到臨床應用的數量要求，還應排除傳播傳染性疾病的可能。質量控制應包括細胞培養的全過程。包括分離細胞前的供體血清學檢測，主要是免疫缺陷病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等。對于原始干細胞數量的檢測，現在唯一的定量檢測是 CFU-F，但是檢測時間太長，不可能在取樣時得到結果，只能作為后續的評判標準。因此，只有檢測有核細胞數和活性來驗證起始干細胞。培養過程中，要不斷監測細胞。當 MSC 被分離出來后，確保分離的細胞質量良好。這些質控包括細胞計數、細胞活性鑒定、表型分析、CFU-F 形成分析，細菌污染檢測等。在治療前必須對細胞進行質量判定，根據質控結果判定這些細胞是否能夠被用于臨床。這些質控方法必須快速、精確，適用于臨床治療要求。這樣的質控包括細胞計數、評價細胞活性和流式測定細胞表型、細菌學檢測、細胞功能、基因穩定性等。通常的 MSC 分化能力鑒定中，誘導分化需要 2～3 周才能知道結果，有研究者提出采用 PCR 方式檢測一些可用于鑒別的基因，以檢測 MSC 是否保持未分化狀態以及它們的分化潛能[132]。近來，MSC 在培養過程中的變異風險引起了大家的注意，如何判定臨床使用經體外擴增培養的 MSC 基因是否突變、細胞是否發生轉化、細胞是否已經老化等問題成為研究者關注的熱點。細胞發生轉化過程主要表現在端粒酶表達、核型突變和注射到免疫缺陷小鼠內生長腫瘤。這些風險使得必須進行特殊的質控，最快速的方法就是通過 QPCR檢測端粒酶。

3 討論

通過對現有綜述、書籍和專利等文獻資料進行綜合對比分析，對大規模臨床級間充質干細胞培養的各方面技術進行了綜合評估。MSC 的來源廣泛，骨髓來源研究最早最多，尤其在免疫調控和分泌因子方面具有其特有的優勢。胎盤、臍帶、羊膜作為分娩后的廢棄物獲取干細胞簡單，對于新生兒及產婦沒有任何痛苦和不良影響，且易于接受，不會涉及社會、倫理及法律方面的更多爭議。其他組織來源如羊水、肌肉、血管、骨組織、骨骼肌、軟骨等從材料來源或倫理上并不適用于臨床大規模生產。因此骨髓、臍帶、臍帶血、胎盤、脂肪等更適用于作為臨床大規模培養 MSC 的來源。

間充質干細胞的分離方法可以采用最少處理的全骨髓法、組織塊法的方式來進行分離，經典的密度梯度分離或流式分選的方式是目前較常用的方法。密度梯度分離液最好使用 GMP 級別的[44]。MSC 大規模培養方式最好選用全封閉條件下的生物反應器培養，但是該方法設備價格比較昂貴，技術要求較高，不好觀察細胞生長情況。因此，目前多數還是在 GMP 實驗室內采用傳統的平面培養方式[53]。在培養基的選擇上，動物源的成分需要用人源的或化學成分確定的成分來代替，以減少可能引起患者致病的風險。如果使用動物源的物質必須根據現有藥品指南的規定，在用于人體前進行殘留量檢測。無血清培養基是臨床級間充質干細胞培養的最終方向。

凍存的 MSC 并不改變 MSC 的生物學特性，如分化能力，生長和表面標志物等。選擇適宜的冷凍保護劑種類和濃度，應確定間充質干細胞在不同凍存保護液下適宜的降溫速率。同時亦需考慮干細胞解凍復蘇后保護劑的清除及保護劑對臨床輸注的影響。DMSO 作為 FDA 批準可以用于臨床的冷凍保護劑，是當前最常用的。其對人體的毒副作用日益受到重視。因此，MSC 凍存保護劑中的DMSO 應在臨床使用前被洗滌和稀釋。玻璃化凍存還有待于進一步得到研究者的公認。開發毒副作用輕微的新型冷凍保護劑也頗為重要。

安全性仍然是細胞治療的主要擔憂之一。培養的細胞在 8～10 代以內安全穩定，無變異，未發現致瘤性，可以安全用于臨床研究使用。為了確保細胞的安全性和有效性，必須建立嚴格的質量控制，包括供體來源，培養過程的微生物檢測，細胞表型、功能分析，細胞活性、數量以及基因穩定性檢測等。

隨著 MSC 臨床應用的增加，建立臨床級間充質干細胞培養的規范直接關系到這個領域能否健康發展。目前，國際組織及一些發達國家，如美國、歐盟、日本、澳大利亞等已經制定了體細胞治療的許多管理規范和標準，如國際細胞治療協會的《干細胞臨床轉化指南》、美國 FDA 的《人類細胞、組織，及細胞和組織相關產品生產的優良操作規范（cGTP）》、歐盟的《人類組織和細胞捐獻、采集、檢測、處理、保存、儲存和分發的質量和安全標準》以及國際細胞治療認證委員會的《細胞治療產品收集、處理和管理國際標準》等[133-143]。我國干細胞治療還缺乏相關的管理規范，亟需權威部門制定一套標準指南，引導我國干細胞臨床研究的健康發展。

[1] Friedenstein AJ, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells.J Embryol Exp Morphol, 1966,16(3):381-390.

[2] Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.Exp Hematol,1976, 4(5):267-274.

[3] Sensebé L, Bourin P, Tarte K.Good manufacturing practices production of mesenchymal stem/stromal cells.Hum Gene Ther, 2011,22(1):19-26.

[4] Battula VL, Bareiss PM, Treml S, et al.Human placenta and bone marrow derived MSC cultured in serum-free, b-FGF-containing medium express cell surface frizzled-9 and SSEA-4 and give rise to multilineage differentiation.Differentiation, 2007, 75(4):279-291.

[5] Insausti CL, Blanquer MB, Olmo LM, et al.Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the fat layer on the density gradient separated bone marrow.Stem Cells Dev, 2012,21(2):260-272.

[6] Banas A.Purification of adipose tissue mesenchymal stem cells and differentiation toward hepatic-like cells.Methods Mol Biol, 2012,826:61-72.

[7] Bayes-Genis A, Soler-Botija C, Farré J, et al.Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents.J Mol Cell Cardiol, 2010, 49(5):771-780.

[8] Can A, Balci D.Isolation, culture, and characterization of human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells.Methods Mol Biol, 2011, 698:51-62.

[9] Conconi MT, Burra P, Di Liddo R, et al.CD105(+) cells from Wharton's jelly show in vitro and in vivo myogenic differentiative potential.Int J Mol Med, 2006, 18(6):1089-1096.

[10] Pereira WC, Khushnooma I, Madkaikar M, et al.Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation.J Tissue Eng Regen Med, 2008, 2(7):394-399.

[11] Huang YC, Yang ZM, Chen XH, et al.Isolation of mesenchymal stem cells from human placental decidua basalis and resistance to hypoxia and serum deprivation.Stem Cell Rev, 2009, 5(3):247-255.

[12] Klein JD, Fauza DO.Amniotic and placental mesenchymal stem cell isolation and culture.Methods Mol Biol, 2011, 698:75-88.

[13] Roubelakis MG, Pappa KI, Bitsika V, et al.Molecular and proteomic characterization of human mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid: comparison to bone marrow mesenchymal stem cells.Stem Cells Dev, 2007, 16(6):931-952.

[14] Sessarego N, Parodi A, Podestà M, et al.Multipotent mesenchymal stromal cells from amniotic fluid: solid perspectives for clinical application.Haematologica, 2008, 93(3):339-346.

[15] Hsiao ST, Asgari A, Lokmic Z, et al.Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue.Stem Cells Dev, 2012, 21(12):2189-2203.

[16] Hung CN, Mar K, Chang HC, et al.A comparison between adipose tissue and dental pulp as sources of MSCs for tooth regeneration.Biomaterials, 2011, 32(29):6995-7005.

[17] Bonfield TL, Colton E, Anderson JM.Protein adsorption of biomedical polymers influences activated monocytes to produce fibroblast stimulating factors.J Biomed Mater Res, 1992, 26(4):457-465.

[18] Futami I, Ishijima M, Kaneko H, et al.Isolation and characterization of multipotential mesenchymal cells from the mouse synovium.PLoS One, 2012, 7(9):e45517.

[19] Hematti P.Human embryonic stem cell-derived mesenchymal progenitors: an overview.Methods Mol Biol, 2011, 690:163-174.

[20] Lai RC, Arslan F, Tan SS, et al.Derivation and characterization of human fetal MSCs: an alternative cell source for large-scale production of cardioprotective microparticles.J Mol Cell Cardiol,2010, 48(6):1215-1224.

[21] Hoogduijn MJ, Crop MJ, Peeters AM, et al.Human heart, spleen, and perirenal fat-derived mesenchymal stem cells have immunomodulatory capacities.Stem Cells Dev, 2007, 16(4):597-604.

[22] Lanzoni G, Alviano F, Marchionni C, et al.Isolation of stem cell populations with trophic and immunoregulatory functions from human intestinal tissues: potential for cell therapy in inflammatory bowel disease.Cytotherapy, 2009, 11(8):1020-1031.

[23] Shaker A, Rubin DC.Intestinal stem cells and epithelial-mesenchymal interactions in the crypt and stem cell niche.Transl Res, 2010,156(3):180-187.

[24] Kassis I, Zangi L, Rivkin R, et al.Isolation of mesenchymal stem cells from G-CSF-mobilized human peripheral blood using fibrin microbeads.Bone Marrow Transplant, 2006, 37(10):967-976.

[25] Mosna F, Sensebé L, Krampera M.Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide.Stem Cells Dev, 2010,19(10):1449-1470.

[26] Erices A, Conget P, Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol, 2000, 109(1):235-242.

[27] Elia L, Arcese W, Torello M, et al. HLA-C and HLA-DQB1 compatibility in unrelated cord blood transplants.Haematologica,1999, 84(6):530-534.

[28] Covas DT, Siufi JL, Silva AR, et al.Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells.Braz J Med Biol Res, 2003, 36(9):1179-1183.

[29] Romanov YA, Svintsitskaya VA, Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSC-like cells from umbilical cord.Stem Cells, 2003,21(1):105-110.

[30] Mitchell KE, Weiss ML, Mitchell BM, et al.Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.Stem Cells, 2003, 21(1):50-60.

[31] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al.Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.Tissue Eng, 2001,7(2):211-228.

[32] Zhang Y, Li CD, Jiang XX, et al.Comparison of mesenchymal stem cells from human placenta and bone marrow.Chin Med J (Engl), 2004,117(6):882-887.

[33] Fukuchi Y, Nakajima H, Sugiyama D, et al.Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential.Stem Cells,2004, 22(5):649-658.

[34] Fauza D.Amniotic fluid and placental stem cells.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2004, 18(6):877-891.

[35] Torricelli F, Brizzi L, Bernabei PA, et al.Identification of hematopoietic progenitor cells in human amniotic fluid before the 12th week of gestation.Ital J Anat Embryol, 1993, 98(2):119-126.

[36] Streubel B, Martucci-Ivessa G, Fleck T, et al.In vitro transformation of amniotic cells to muscle cells--background and outlook.Wien Med Wochenschr, 1996, 146(9-10):216-217.

[37] In 't Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der Keur C, et al.Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.Stem Cells, 2004, 22(7):1338-1345.

[38] Fernández M, Simon V, Herrera G, et al.Detection of stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients.Bone Marrow Transplant, 1997, 20(4):265-271.

[39] Wexler SA, Donaldson C, Denning-Kendall P, et al.Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not.Br J Haematol, 2003,121(2):368-374.

[40] Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, et al.Human bone marrow-derived mesenchymal (stromal) progenitor cells (MPCs)cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections.J Hematother, 1997, 6(5):447-455.

[41] Gronthos S, Zannettino AC, Hay SJ, et al.Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow.J Cell Sci, 2003, 116(Pt 9):1827-1835.

[42] Deschaseaux F, Charbord P.Human marrow stromal precursors are alpha 1 integrin subunit-positive.J Cell Physiol, 2000, 184(3):319-325.

[43] Deschaseaux F, Gindraux F, Saadi R, et al.Direct selection of human bone marrow mesenchymal stem cells using an anti-CD49a antibody reveals their CD45med, low phenotype.Br J Haematol, 2003, 122(3):506-517.

[44] Grisendi G, Annerén C, Cafarelli L, et al.GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion.Cytotherapy, 2010, 12(4):466-477.

[45] Rojewski MT, Fekete N, Baila S, et al.GMP-compliant isolation and expansion of bone marrow-derived MSCs in the closed, automated device Quantum cell expansion system.Cell Transplant, 2012.

[46] dos Santos F, Andrade PZ, Eibes G, et al.Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers.Methods Mol Biol, 2011,698:189-198.

[47] Frith JE, Thomson B, Genever PG.Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.Tissue Eng Part C Methods, 2010, 16(4):735-749.

[48] Gómez-Sj?berg R, Leyrat AA, Pirone DM, et al.Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system.Anal Chem, 2007,79(22):8557-8563.

[49] Petrenko YA, Petrenko AY, Damshkaln LG, et al.Growth and adipogenic differentiation of mesenchymal stromal bone marrow cells during culturing in 3D macroporous agarose cryogel sponges.Bull Exp Biol Med, 2008, 146(1):129-132.

[50] Santos Fd, Andrade PZ, Abecasis MM, et al.Toward a clinical-grade expansion of mesenchymal stem cells from human sources: a microcarrier-based culture system under xeno-free conditions.Tissue Eng Part C Methods, 2011, 17(12):1201-1210.

[51] Schneider PR, Buhrmann C, Mobasheri A, et al. Three-dimensional high-density co-culture with primary tenocytes induces tenogenic differentiation in mesenchymal stem cells.J Orthop Res, 2011,29(9):1351-1360.

[52] Martin Y, Eldardiri M, Lawrence-Watt DJ, et al.Microcarriers and their potential in tissue regeneration.Tissue Eng Part B Rev, 2011,17(1):71-80.

[53] Sensebé L.Clinical grade production of mesenchymal stem cells.Biomed Mater Eng, 2008, 18(1 Suppl):S3-S10.

[54] Kocaoemer A, Kern S, Klüter H, et al.Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue.Stem Cells, 2007, 25(5):1270-1278.

[55] Spees JL, Gregory CA, Singh H, et al.Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.Mol Ther, 2004, 9(5):747-756.

[56] Müller I, Kordowich S, Holzwarth C, et al.Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM.Cytotherapy, 2006, 8(5):437-444.

[57] Centeno CJ, Schultz JR, Cheever M, et al.Safety and complications reporting on the re-implantation of culture-expanded mesenchymal stem cells using autologous platelet lysate technique.Curr Stem Cell Res Ther, 2010, 5(1):81-93.

[58] Blande IS, Bassaneze V, Lavini-Ramos C, et al.Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.Transfusion,2009, 49(12):2680-2685.

[59] Carrancio S, López-Holgado N, Sánchez-Guijo FM, et al.Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification.Exp Hematol, 2008,36(8):1014-1021.

[60] Haack-Sorensen M, Friis T, Bindslev L, et al.Comparison of different culture conditions for human mesenchymal stromal cells for clinical stem cell therapy.Scand J Clin Lab Invest, 2008, 68(3):192-203.

[61] Hatlapatka T, Moretti P, Lavrentieva A, et al.Optimization of culture conditions for the expansion of umbilical cord-derived mesenchymal stem or stromal cell-like cells using xeno-free culture conditions.Tissue Eng Part C Methods, 2011, 17(4):485-493.

[62] Hirata TM, Ishkitiev N, Yaegaki K, et al.Expression of multiple stem cell markers in dental pulp cells cultured in serum-free media.J Endod,2010, 36(7):1139-1144.

[63] Jung S, Panchalingam KM, Rosenberg L, et al.Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells in defined serum-free media.Stem Cells Int, 2012, 2012:123030.

[64] Jung S, Panchalingam KM, Wuerth RD, et al.Large-scale production of human mesenchymal stem cells for clinical applications.Biotechnol Appl Biochem, 2012, 59(2):106-120.

[65] Jung S, Sen A, Rosenberg L, et al.Human mesenchymal stem cell culture: rapid and efficient isolation and expansion in a defined serum-free medium.J Tissue Eng Regen Med, 2012, 6(5):391-403.

[66] Lange C, Cakiroglu F, Spiess AN, et al.Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine.J Cell Physiol,2007, 213(1):18-26.

[67] Meuleman N, Tondreau T, Delforge A, et al.Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical alpha-MEM medium.Eur J Haematol, 2006,76(4):309-316.

[68] Mimura S, Kimura N, Hirata M, et al.Growth factor-defined culture medium for human mesenchymal stem cells.Int J Dev Biol, 2011,55(2):181-187.

[69] Schallmoser K, Strunk D.Preparation of pooled human platelet lysate(pHPL) as an efficient supplement for animal serum-free human stem cell cultures.J Vis Exp, 2009, (32).pii: 1523.

[70] Shetty P, Bharucha K, Tanavde V.Human umbilical cord blood serum can replace fetal bovine serum in the culture of mesenchymal stem cells.Cell Biol Int, 2007, 31(3):293-298.

[71] Solmesky L, Lefler S, Jacob-Hirsch J, et al.Serum free cultured bone marrow mesenchymal stem cells as a platform to characterize the effects of specific molecules.PLoS One, 2010, 5(9).pii: e12689.

[72] Sotiropoulou PA, Perez SA, Salagianni M, et al.Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.Stem Cells, 2006, 24(5):1409-1410.

[73] Stute N, Holtz K, Bubenheim M, et al.Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use.Exp Hematol, 2004, 32(12):1212-1225.

[74] Tateishi K, Ando W, Higuchi C, et al.Comparison of human serum with fetal bovine serum for expansion and differentiation of human synovial MSC: potential feasibility for clinical applications.Cell Transplant, 2008, 17(5):549-557.

[75] Tekkatte C, Gunasingh GP, Cherian KM, et al."Humanized" stem cell culture techniques: the animal serum controversy.Stem Cells Int, 2011,2011:504723.

[76] Yilmaz M, Ovali E, Akdogan E, et al.Autologous serum is more effective than fetal bovine serum on proliferation of bone marrow derived human mesenchymal stem cells.Saudi Med J, 2008,29(2):306-309.

[77] Angelo PC, Ferreira AC, Fonseca VD, et al.Cryopreservation does not alter karyotype, multipotency, or NANOG/SOX2 gene expression of amniotic fluid mesenchymal stem cells.Genet Mol Res, 2012,11(2):1002-1012.

[78] Di G, Wang J, Liu M, et al.Development and evaluation of a trehalose-contained solution formula to preserve hUC-MSCs at 4 ℃.J Cell Physiol, 2012, 227(3):879-884.

[79] Ding G, Wang W, Liu Y, et al.Effect of cryopreservation on biological and immunological properties of stem cells from apical papilla.J Cell Physiol, 2010, 223(2):415-422.

[80] Gong W, Han Z, Zhao H, et al.Banking human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells for clinical use.Cell Transplant, 2012,21(1):207-216.

[81] Grein TA, Freimark D, Weber C, et al.Alternatives to dimethylsulfoxide for serum-free cryopreservation of human mesenchymal stem cells.Int J Artif Organs, 2010, 33(6):370-380.

[82] Hunt CJ.Cryopreservation of human stem cells for clinical application:a review.Transfus Med Hemother, 2011, 38(2):107-123.

[83] Lee MW, Yang MS, Park JS, et al.Isolation of mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord blood.Int J Hematol,2005, 81(2):126-130.

[84] Mamidi MK, Nathan KG, Singh G, et al.Comparative cellular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells during continuous passaging and after successive cryopreservation.J Cell Biochem, 2012, 113(10):3153-3164.

[85] Xiang Y, Zheng Q, Jia BB, et al.Ex vivo expansion and pluripotential differentiation of cryopreserved human bone marrow mesenchymal stem cells.J Zhejiang Univ Sci B, 2007, 8(2):136-146.

[86] Xiong ZH, Xu Q, Lu DY, et al.Differentiation of cryopreserved human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells.J Clin Rehabilitative Tissue Eng Res, 2007,11(7):1252-1255.(in Chinese)熊中華, 許倩, 陸德云, 等.凍存人臍血間充質干細胞向類肝細胞的誘導分化.中國組織工程研究與臨床康復, 2007, 11(7):1252-1255.

[87] Zhang SZ, Qian H, Wang Z, et al.Preliminary study on the freezedrying of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.J Zhejiang Univ Sci B, 2010, 11(11):889-894.

[88] Wang Y, Han ZB, Song YP, et al.Safety of mesenchymal stem cells for clinical application.Stem Cells Int, 2012, 2012:652034.

[89] Achille V, Mantelli M, Arrigo G, et al.Cell-cycle phases and genetic profile of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells expanded in vitro from healthy donors.J Cell Biochem, 2011, 112(7):1817-1821.

[90] Baxter MA, Wynn RF, Jowitt SN, et al.Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion.Stem Cells, 2004, 22(5):675-682.

[91] Ben-David U, Mayshar Y, Benvenisty N.Large-scale analysis reveals acquisition of lineage-specific chromosomal aberrations in human adult stem cells.Cell Stem Cell, 2011, 9(2):97-102.

[92] Ben-David U, Mayshar Y, Benvenisty N.Significant acquisition of chromosomal aberrations in human adult mesenchymal stem cells:Response to Sensebé et al.Cell Stem Cell, 2012, 10(1):10-11.

[93] Christensen R, Alsner J, Brandt Sorensen F, et al.Transformation of human mesenchymal stem cells in radiation carcinogenesis: long-term effect of ionizing radiation.Regen Med, 2008, 3(6):849-861.

[94] Cremona CA, Lloyd AC.Loss of anchorage in checkpoint-deficient cells increases genomic instability and promotes oncogenic transformation.J Cell Sci, 2009, 122(Pt 18):3272-3281.

[95] Crespo-Diaz R, Behfar A, Butler GW, et al.Platelet lysate consisting of a natural repair proteome supports human mesenchymal stem cell proliferation and chromosomal stability.Cell Transplant, 2011,20(6):797-811.

[96] Dahl JA, Duggal S, Coulston N, et al.Genetic and epigenetic instability of human bone marrow mesenchymal stem cells expanded in autologous serum or fetal bovine serum.Int J Dev Biol, 2008,52(8):1033-1042.

[97] Estrada JC, Albo C, Benguría A, et al.Culture of human mesenchymal stem cells at low oxygen tension improves growth and genetic stability by activating glycolysis.Cell Death Differ, 2012, 19(5):743-755.

[98] Ferreira RJ, Irioda AC, Cunha RC, et al.Controversies about the chromosomal stability of cultivated mesenchymal stem cells: their clinical use is it safe? Curr Stem Cell Res Ther, 2012, 7(5):356-363.

[99] Hiyama E, Hiyama K.Telomere and telomerase in stem cells.Br J Cancer, 2007, 96(7):1020-1024.

[100] Kara?z E, Ok?u A, Gacar G, et al.A comprehensive characterization study of human bone marrow mscs with an emphasis on molecular and ultrastructural properties.J Cell Physiol, 2011, 226(5):1367-1382.

[101] Miura M, Miura Y, Padilla-Nash HM, et al.Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stem cells leads to malignant transformation.Stem Cells, 2006, 24(4):1095-1103.

[102] Prockop DJ, Keating A.Relearning the lessons of genomic stability of human cells during expansion in culture: implications for clinical research.Stem Cells, 2012, 30(6):1051-1052.

[103] Rodríguez-Jiménez FJ, Moreno-Manzano V, Lucas-Dominguez R, et al.Hypoxia causes downregulation of mismatch repair system and genomic instability in stem cells.Stem Cells, 2008, 26(8):2052-2062.

[104] Roschke AV, Glebov OK, Lababidi S, et al.Chromosomal instability is associated with higher expression of genes implicated in epithelial-mesenchymal transition, cancer invasiveness, and metastasis and with lower expression of genes involved in cell cycle checkpoints,DNA repair, and chromatin maintenance.Neoplasia, 2008, 10(11):1222-1230.

[105] Ross AL, Leder DE, Weiss J, et al.Genomic instability in cultured stem cells: associated risks and underlying mechanisms.Regen Med,2011, 6(5):653-662.

[106] Saito S, Morita K, Kohara A, et al.Use of BAC array CGH for evaluation of chromosomal stability of clinically used human mesenchymal stem cells and of cancer cell lines.Hum Cell, 2011,24(1):2-8.

[107] Takeuchi M, Takeuchi K, Kohara A, et al.Chromosomal instability in human mesenchymal stem cells immortalized with human papilloma virus E6, E7, and hTERT genes.In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2007,43(3-4):129-138.

[108] Tonti GA, Mannello F.From bone marrow to therapeutic applications:different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera? Int J Dev Biol, 2008, 52(8):1023-1032.

[109] van Wely KH, Martínez-A C.Linking stem cells to chromosomal instability.Oncoimmunology, 2012, 1(2):195-200.

[110] Wagner W, Ho AD, Zenke M.Different facets of aging in human mesenchymal stem cells.Tissue Eng Part B Rev, 2010, 16(4):445-453.

[111] Centeno CJ, Schultz JR, Cheever M, et al.Safety and complications reporting update on the re-implantation of culture-expanded mesenchymal stem cells using autologous platelet lysate technique.Curr Stem Cell Res Ther, 2011, 6(4):368-378.

[112] Giammo A, Tomasi S, Boido M, et al.Preclinical study for the assessment of safety of human mesenchimal stem cells transplantation in the external urethral sphincter: Long term results.Neurourology Urodynamics, 2011, 30(Suppl 1):37-38.

[113] Herberts CA, Kwa MS, Hermsen HP.Risk factors in the development of stem cell therapy.J Transl Med, 2011, 9:29.

[114] Prockop DJ, Brenner M, Fibbe WE, et al.Defining the risks of mesenchymal stromal cell therapy.Cytotherapy, 2010, 12(5):576-578.

[115] Weber CE, Talbot LJ, Wai PY, et al.Transformation of mesenchymal stem cells into cancer associated fibroblasts within the tumor microenvironment.J Surg Res, 2012, 172(2):243.

[116] Yamaoka E, Hiyama E, Sotomaru Y, et al.Neoplastic transformation by TERT in FGF-2-expanded human mesenchymal stem cells.Int J Oncol, 2011, 39(1):5-11.

[117] Wagner W, Ho AD.Mesenchymal stem cell preparations--comparing apples and oranges.Stem Cell Rev, 2007, 3(4):239-248.

[118] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy, 2006,8(4):315-317.

[119] Angstmann M, Brinkmann I, Bieback K, et al.Monitoring human mesenchymal stromal cell differentiation by electrochemical impedance sensing.Cytotherapy, 2011, 13(9):1074-1089.

[120] Boucher S, Lakshmipathy U, Vemuri M.A simplified culture and polymerase chain reaction identification assay for quality control performance testing of stem cell media products.Cytotherapy, 2009,11(6):761-767, 767.e1-e2.

[121] Brooke G, Rossetti T, Ilic N, et al.Points to consider in designing mesenchymal stem cell-based clinical trials.Transfus Med Hemother,2008, 35(4):279-285.

[122] Burunova VV, Suzdaltseva YG, Voronov AV, et al.Development and introduction of production standards for cell products of mesenchymal origin.Bull Exp Biol Med, 2008, 145(4):526-530.

[123] Kawauchi S, Terasaki H, Katano M, et al.Quality control and monitoring for the isolation process of mesenchymal stem cells and their differentiation into osteoblasts.Genet Test Mol Biomarkers, 2010,14(2):269-282.

[124] Mehr M, Bertolo A, Aebli N, et al.The loss of differentiation potential of human mesenchymal stem cells can be predicted by use of a set of senescence markers.Eur Cells Mater, 2010, 20(Suppl 2):50.

[125] Rebulla P, Giordano R.Regulation of cell based medicine.The European experience.The case of Mesenchymal stem cell production for clinical applications.Vox Sanguinis, 2010, 99(Suppl 1):69-70.

[126] Sensebé L, Bourin P.Producing MSC according GMP: process and controls.Biomed Mater Eng, 2008, 18(4-5):173-177.

[127] Sensebé L, Bourin P.Mesenchymal stem cells for therapeutic purposes.Transplantation, 2009, 87(9 Suppl):S49-S53.

[128] Thomas RJ, Chandra A, Hourd PC, et al.Cell culture automation and quality engineering: a necessary partnership to develop optimized manufacturing processes for cell-based therapies.J Assoc Lab Automation, 2008, 13(3):152-158.

[129] Thomas RJ, Hourd PC, Williams DJ.Application of process quality engineering techniques to improve the understanding of the in vitro processing of stem cells for therapeutic use.J Biotechnol, 2008,136(3-4):148-155.

[130] Veyrat-Masson R, Boiret-Dupré N, Rapatel C, et al.Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy.Br J Haematol, 2007, 139(2):312-320.

[131] Martín PG, González MB, Martínez AR, et al.Isolation and characterization of the environmental bacterial and fungi contamination in a pharmaceutical unit of mesenchymal stem cell for clinical use.Biologicals, 2012, 40(5):330-337.

[132] Delorme B, Ringe J, Pontikoglou C, et al.Specific lineage-priming of bone marrow mesenchymal stem cells provides the molecular framework for their plasticity.Stem Cells, 2009, 27(5):1142-1151.

[133] Petrini C.European regulations on cord blood banking: an overview.Transfusion, 2012, 52(3):668-679.

[134] U.S.Food and Drug Administration.Guidance for FDA reviewers and sponsors: content and review of chemistry, manufacturing, and control(cmc) information for human somatic cell therapy investigational new drug applications (INDs).(2008-04) [2013-01-10].http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInforma tion/Guidances/Xenotransplantation/ucm074131.htm.

[135] U.S.Food and Drug Administration.Guidance for industry: current good tissue practice (CGTP) and additional requirements for manufacturers of human cells, tissues, and cellular and tissue-based products (HCT/Ps).(2011-12) [2013-01-10].http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryI nformation/Guidances/Tissue/UCM285223.pdf.

[136] U.S.Food and Drug Administration.Guidance for industry: regulation of human cells, tissues, and cellular and tissue-based products(HCT/Ps) - small entity compliance guide.(2007-08) [2013-01-10].http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRe gulatoryInformation/Guidances/Tissue/ucm073366.htm.

[137] U.S.Food and Drug Administration.Guidance for industry: source animal, product, preclinical, and clinical issues concerning the use of xenotransplantation products in humans.(2003-04) [2013-01-10].http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRe gulatoryInformation/Guidances/Xenotransplantation/ucm074354.htm.

[138] U.S.Food and Drug Administration.Guidance for reviewers:instructions and template for chemistry, manufacturing, and control(CMC) reviewers of human somatic cell therapy investigational new drug applications (INDs).(2003-08) [2013-01-10].http://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/98fr/03d0349gdl.pdf.

[139] Ryuji Tanosaki, Kazuo Muroi, Tokiko Nagamura-Inoue, et al.Guideline for processing cellular therapy products routinely used for hematopoietic stem cell transplantation in Japan.Jpn J Transfus Cell Ther, 2011, 57(3):184-187.

[140] Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT), Joint Accreditation Committee - Isct and Ebmt (JACIE).International standards for cellular therapy pooduct collection, processing, and administration accreditation manumal.(2011-03) [2013-01-10].http://www.factwebsite.org/uploadedFiles/FACT_News/Final Draft 5th Edition Accreditation Manual.04.18.11.pdf.

[141] Committee for Advanced Therapies (CAT), CAT Scientific Secretariat,Schneider CK, et al.Challenges with advanced therapy medicinal products and how to meet them.Nat Rev Drug Discov, 2010, 9(3):195-201.

[142] International Society for Stem Cell Research.Guidelines for the clinical translation of stem cells.(2008-12-03) [2013-01-10].http://www.isscr.org/docs/guidelines/isscrglclinicaltrans.pdf.

[143] The Therapeutic Goods Administration of the Australian Government Department of Health and Ageing.Australian regulatory guidelines for biologicals (ARGB).(2011-08-29) [2013-01-10].http://www.tga.gov.au/industry/biologicals-argb.htm.