抗生素新靶位的研究進展

李國梁，曹榮月，顧覺奮

目前臨床上應用的大多數抗生素只能殺死或抑制指數方式增長的細菌，而對慢速生長的菌株沒有好的效果，因而容易產生二次感染，即疾病感染的持久性。而且大多數藥物是原有抗生素的衍生物，不能從根本上解決細菌的耐藥性。另外，臨床上許多致病菌不斷表現出耐藥性與多藥耐藥性（MDR），讓臨床治療微生物感染疾病更加捉襟見肘。致病菌常見的耐藥機制包括：①阻止藥物進入細胞；②外排泵；③改變或修飾藥物作用的靶位；④產生鈍化酶；⑤形成救護機制，即形成新的代謝途徑代替原來被阻斷的代謝途徑來合成原來的代謝產物；⑥快速增長和緩慢增長的細菌，增殖和不增殖的細菌共存。要成為一種潛在的新穎的抗生素，其作用靶位一般應具有如下特點：①靶點在真菌、細菌等微生物中廣泛存在；②靶點在真核細胞中不存在，即沒有毒性作用；③靶點參與真菌、細菌的致病過程；④能通過高通量篩選的方法篩選獲得活性化合物；⑤不產生交叉耐藥性。本綜述主要對多種潛在的新穎的藥物作用靶點進行介紹，希望能為新型抗生素藥物的研發提供方向。

1 抗真菌藥物的新作用靶點

現階段臨床上應用的抗真菌藥物主要有：丙烯胺類（如特比萘芬）、多烯類（兩性霉素 B 及制霉菌素）、唑類（如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等）和嘧啶類（如 5-氟胞嘧啶），它們的功能依次是作用于角鯊烯環氧化酶、真菌細胞膜、真菌細胞 P450 依賴酶以及干擾真菌核酸合成。但是這些抗真菌藥都對人體產生毒副作用，比如兩性霉素 B 對腎有一定的毒性，唑類藥物同時作用于真菌 P450 依賴酶和哺乳動物的 P450 依賴酶，因此會對肝有一定的毒性等。新型作用靶點的研究將可以降低藥物毒副作用，目前研究較為集中的有如下幾點。

1.1 真菌細胞壁

細胞壁只存在于真菌細胞，哺乳動物細胞不具有，真菌細胞壁的代謝在真菌生長和分裂過程中發揮重要作用。細胞壁的功能是維持細胞內滲透壓的平衡以及菌體的完整性，一旦遭破壞，菌體將溶解死亡。真菌細胞壁由幾丁質、β-(1,3)-D-葡聚糖和甘露糖蛋白三種成分組成。抑制細胞壁組分的合成或破壞其結構，可以達到抑制、殺滅真菌的效果。

尼柯霉素類藥物與棘白菌素類藥物是典型的以真菌細胞壁為靶點的抗真菌藥[1-2]。尼柯霉素類藥主要抑制真菌細胞壁專有的幾丁質合成酶，干擾幾丁質的合成。棘白菌素類藥能特異性抑制真菌細胞壁 β-(1,3)-D-葡聚糖的合成，是β-(1,3)-D-葡聚糖抑制劑。兩者通過破壞真菌細胞壁的完整性與細胞內滲透壓使真菌細胞溶解死亡[3]。

1.2 延長因子

延長因子是蛋白合成時需要的水溶性蛋白因子，真菌細胞延長因子主要包括：延長因子 EF-1、EF-2 和 EF-3。它們是蛋白質合成所必需的，參與 mRNA 核糖體解碼和多肽合成。真菌和哺乳動物細胞中只有 EF-1 和 EF-2，并且其結構與真菌細胞 EF-1 和 EF-2 差異很大，而 EF-3 為真菌所特有（哺乳動物細胞中不存在），說明 EF-3 是抗真菌藥物設計中的重要靶點。至今還沒有發現選擇性作用于 EF-3的化合物，這暗示選擇性 EF-3 抑制劑將是一類很有潛力的廣譜抗真菌藥物。

目前已研發出的選擇性 EF-2 抑制劑，作用于蛋白質的翻譯過程，比如糞殼菌素及其衍生物，在念珠菌和新型隱球菌中抑制蛋白合成效果較好[4]。另外研究發現，新型糞殼菌素及其衍生物 GM2211676、GM2237354 和 GM2193663在小鼠網狀內皮細胞真菌模型中有很好的體外抑制活性。

1.3 雙組分信號轉導系統

雙組分信號轉導系統通過影響相關基因的表達，從而間接地參與細胞生長發育與致病過程。雙組分信號轉導系統主要由組氨酸激酶（HK）和反應調節蛋白（RR）組成。由于只有細菌、真菌細胞編碼 HK 與 RR 基因，而在哺乳動物細胞中不編碼，所以雙組分信號轉導系統是一種潛在的新型藥物靶位[5]。通過研發雙組分信號轉導系統抑制劑，開發出新型的藥物來應對臨床常見耐藥菌將成為可能。

雙組分信號轉導系統作用過程：細胞膜的感受器激酶接收刺激信號后，自動磷酸化一個保守的組氨酸殘基，然后該磷酸基轉移到反應調節蛋白接受域一個保守的天冬氨酸殘基上，進而活化或抑制反應調節蛋白，最后激活或抑制基因表達。

目前，雙組分信號轉導系統在白色念珠菌中研究比較清楚，通過基因敲除技術，HK 及 RR 的功能已基本被確定，這些雙組分信號轉導蛋白在菌絲-孢子形態轉換、細胞適應高滲透壓及氧化刺激、細胞壁生物合成以及毒力方面有著重要作用[6]。分別靶向 HK 與 RR 的藥物，都能很好地抑制雙組分信號轉導系統功能活性。但是，靶向雙組分信號轉導系統中 HK 感受域由于選擇性較差將被淘汰，而靶向感受器的傳感域（傳出信號結構）與靶向 RR 因其更加有選擇性與效果而成為研究重點。

2 抗細菌藥物的新作用靶點

2.1 雙組分信號轉導系統蛋白

雙組分信號轉導系統不僅存在于真菌細胞中，同時也存在于細菌細胞中，其機制與 1.3 相似。

2.2 細菌細胞分裂蛋白

細菌細胞分裂蛋白（FtsZ）是細胞分裂關鍵的蛋白，廣泛作用于細菌的細胞分裂。當細胞分裂時，單體 FtsZ 蛋白依次連接，GTP 結合位點位于連續亞基軸連接界面，組裝形成極纖維，進而在分裂位點形成與細胞質膜內表面鑲嵌的Z-ring（Z 環），此環所在的平面恰好平分待分裂母細胞。在 GTP 水解供能及眾多調節蛋白的作用下，Z-ring 參與DNA 的分離和細胞生長等重要生理過程[7]。因此，FtsZ 蛋白為探尋抗菌新靶位提供方向，通過抑制 FtsZ 蛋白的組裝達到抗菌作用。

FtsZ 蛋白分子與真核微管蛋白有類似的結構折疊，是結構同族體。FtsZ 多聚體纖維結構，N端擁有 GTPase 活性域和核苷酸連接域，兩者之間是一較長間隙（cleft），而 C 端沒有特殊活性區域，部分序列可以進入 cleft，調節N 端兩活性區域。而后形成的 FtsZ-ring 緊密拴住質膜內側，經 GTP 的重復水解，為質膜收縮提供動力并順利分裂細胞。

研究者普遍認為，配基若結合單體蛋白更趨向抑制組裝，而結合多聚體上則促進組裝過程。所以，可以直接以FtsZ 為靶位，如靶向 N 端的 GTPase 活性域和核苷酸連接域，從而影響或抑制組裝。另外，有研究表明，單體 FtsZ中都植入了啟動 FtsZ 組裝的開關（switch），而 C 端序列移向 N 端并關閉兩活性結構域之間的 cleft 是組裝開關啟動所必需的[7]。所以，尋找適合的配基，靶向此 cleft，阻止它的關閉，可達到抗菌作用。

2.3 氫化酶

氫化酶（hydrogenase）催化可逆氧化反應（H22H +2e），在微生物（古生菌與細菌）生存中起到多種作用。研究表明，H2是一種潛在的抗氧化劑，并且能特異中和 OH·（羥基自由基）。已有研究預測，OH· 是抗生素與非特異性免疫系統誘導的殺菌的主要物質[8]。除了靶點抗生素，其他主要的抗生素都能促進 G–與 G+菌產生高度有毒的OH·，最終導致細菌細胞的死亡。OH· 主要通過改變三羧酸循環（TCA）與超活化電子傳遞鏈（ETC）系統而殺菌。另外，通過（超氧陰離子）清除細菌也是非特異免疫系統抵抗病菌感染的重要機制。當細菌被相應的吞噬細胞吞沒，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase）就能產生。進而破壞鐵硫族，將亞鐵離子進行 fenton 反應，產生 OH·，OH· 反過來損壞細菌 DNA、蛋白質與脂類，從而殺滅細菌（圖 1）。但由于細菌本身氫化酶的存在，產生 H2，中和大部分 OH·，從而產生抗性。因此，靶向抑制氫化酶的生物活性分子有待發現。

2.4 維生素 H 蛋白連接酶

圖1 OH· 介導細菌死亡的共同途徑

維生素 H 蛋白連接酶（BPL）普遍存在于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及人體內，主要是將輔因子 biotin 連接到依賴 biotin 的酶上，從而啟動相應酶的活性[9]。另外，BPL是所有 biotin 參與調節的生物事件的主要調節蛋白。如脂肪酸的生物合成是生物膜不可或缺的，而 BPL 又是脂肪酸的生物合成必不可少的。所以，在抗生素研究中，BPL 是種潛在新穎的藥物靶點。

在轉移輔因子 biotin 反應中，首先是 biotin 與 ATP作用產生 biotinyl-5'-AMP，然后 biotinyl-5'-AMP 將 biotin轉移到依賴 biotin 的某特定賴氨酸殘基上。在這過程中，biotin 主要是促進代謝產物的羧化作用。

2.5 RNA 聚合酶

細菌 RNA 聚合酶（RNA polymerase）是大部分細菌RNA 合成的關鍵酶，且其亞基序列高度保守而在真核RNAP I、RNAP II、RNAP III 的亞基序列中高度不保守。

Switch region，是細菌 RNAP 中一保守結構域，由switch 1～switch 5 組成。大部分的細菌都含有此結構域，并且非常保守；在轉錄起始時，RNAP 將 DNA 載入到RNAP 活性中心縫隙結構，在此過程中，switch region 中的五部分結構發生一系列變化，即通過調節信息交換與接觸，RNAP 關閉復合物（RPc）構型轉向 RNAP 開放復合物（RPo），進而啟動轉錄。如果一些化合物與 switch region結合后，可抑制 RNAP RPc 向 Rpo 的異構化過程，使RNAP 失去活性，從而阻止轉錄，達到抗菌的效果[10]。所以 switch region 是一個新穎的潛在藥物作用新靶位。另外，switch region 與其他抗菌劑的靶點不同，不會出現交叉耐藥性，如與利福霉素結合位點不重疊。圖 2A 為 RPo，B 為RPc。

2.6 RNA 降解

病原菌（G–與 G+菌）或宿主細胞 mRNA 的周轉更替（即降解）過程均有特異的多蛋白復合物組成的降解體參與其中，其降解機制如圖 3[11]所示。

圖2 RNA 聚合酶夾與轉換區構象

圖3 G– 菌（A）、G+ 菌（B）與真核（C）細胞 mRNA 降解的機制

2.6.1 G–菌 mRNA 降解機制 G–菌 mRNA 降解體是多蛋白復合物，由RhlB、enolase、PNPase 和 RNase E 組成（圖 3A）。RNase E 的內切作用啟動 mRNA 的降解，RNase E 靶向切割 5' 端的單磷酸轉錄子（由三磷酸化轉錄子經 RppH 水解而得）；mRNA 降解依賴 RNase G、RNase P、RNase I 和 RNase III 4 種內切酶，前 3 個主要切割單鏈 RNA（ssRNA），而 RNase III 識別并切割雙鏈RNA 的二級結構（dsRNA）；經 4 種內切酶酶切而得到的大片段進一步被 PNPase 或 3' → 5' 外切酶 RNase R 和RNase II 降解成更小片段；最后 3' → 5' 外切酶 Orn 則將小片段降解成單核苷酸。

2.6.2 G+菌 mRNA 降解機制 G+菌 mRNA 降解體也是多蛋白復合物，由 RNase J1、RNase J2、RNase Y、enolase、RNA helicase（CshA）、PNPase、phosphofructokinase（pfk）與 RnpA 構成（圖 3B）。RNase J1 的內部切割啟動 mRNA降解，RNase J1 趨向切割 5' 端的單磷酸轉錄子（由三磷酸化轉錄子經 RppH 水解而得）；其他降解體中關鍵內切酶有RNase J2、RNase Y、RnpA 與 RNase III，前 3 個主要切割單鏈 RNA（ssRNA），而 RNase III 識別并切割雙鏈 RNA的二級結構（dsRNA）；內切酶降解所得片段進而被 3' → 5'外切酶 PNPase 與 RNase R 降解成小片段；這些小片段再由 5' → 3' 外切酶 RNase J1 徹底降解成單核苷酸。

表1 抗細菌潛在新作用靶點的作用機制及其抑制劑

2.6.3 真核細胞 mRNA 降解機制 真核細胞 mRNA 的降解由外切體介導，此外切體由 Rrp41、Rrp42、Mtr3、OIP2、Rrp46 與 PM-Sc175 依次相接而成的環狀結構和 Rrp4、Rrp40 與 Cs14 構成的帽子結構兩部分組成（圖 3C）。另外，外切體的中心部分連接了 3' → 5' 外切酶 DIS3、PM-Sc1100 和 DIS3L（同時具有內切活性）。多聚腺苷酶水解多聚尾與 Dcp1/Dcp2 復合物或內切酶 DIS3L 脫去5' 端的帽子結構，促進 mRNA 降解起始；沒帽子和尾巴的mRNA 極易被 3' → 5' 外切酶 DIS3、PM-Sc1100、DIS3L和 5' → 3' 外切酶 XRN1 或 XRN2 降解。

通過了解上述 3 種機制，再考慮每種細菌降解體中酶的保守性和同源性，經 ESKAPE 病原體核糖核酸酶實驗，得到結論：G+菌的 RNase J1、G–菌的 RNase E、G+及 G–菌的 RNase P 與 RnpA 兩者中的蛋白成分均是潛在的抗生素作用的新穎靶位。

2.7 rpoD 基因

rpoD（編碼 RNA 聚合酶起始因子 σ）廣泛存在于耐藥菌與多藥耐藥G–菌（MDR-GNB）等細菌中，高度保守，且在真核細胞的基因沒有同源序列，主要是編碼 DNA 轉錄過程中必不可少的 σ 因子[12]。rpoD 是有義鏈轉錄所得mRNA 的一段基因序列，反義鏈轉錄的 RNA 能與之完全互補配對。所以，通過提取、人為合成一段反義寡核苷酸序列，或再將其修飾，與 rpoD 互補配對，就可達到抑制或減弱 rpoD 的表達，獲得抗菌效應，即反義抗生素（反義寡核苷酸序列或其衍生物）。PPNA06 是目前發現的一種反義肽核酸復合物，即一段反義 RNA 衍生物，能與 rpoD 互補配對，能很好地減弱或抑制 rpoD 基因的表達。

2.8 核糖開關

核糖開關（riboswitches）是 mRNA 中的某區域，能依據細胞內各種代謝產物與第二信使的濃度大小調節相應基因表達；riboswitches 廣泛存在于細菌中，而在真核細胞中幾乎不存在；riboswitches 調控致病菌中許多重要基因，并且它的配基結合口袋擁有多種多樣的識別微型分子機制[10]。Riboswitches 主要擁有適配區和表達平臺兩區域。通過設計微型分子與適配區結合，改變相應核苷酸序列的折疊，從而改變對應的功能活性；而表達平臺則是將微型分子與適配區結合的信號傳導至基因表達系統。兩者協同調節相關基因的表達，通常是抑制或衰減基因的表達，從而達到抗菌作用。通過高通量篩選技術，發現了以核糖開關為靶點的幾種先導化合物，如玫瑰黃色素（roseoflavin）、吡啶硫胺（pyrithiamine，PT）、L-氨乙基半胱氨酸（L-aminoethylcysteine）、DL-4-氧代賴氨酸（DL-4-oxalysine）等[13]。

2.9 NDM-1

β-內酰胺 B 類酶 NDM-1 廣泛存在于超級細菌中，能分解多種 β-內酰胺類抗生素，是人類治療超細菌感染疾病的挑戰。以 NDM-1 為作用靶點，探尋抑制 NDM-1 酶活性的抗生素越來越受注視。經研究表明，NDM-1 具有多種β-內酰胺類抗生素結合域，能將 β-內酰胺類抗生素充當底物，并將其分解。這種底物結合的方式并不導致 NDM-1 的變構，即活性不改變。所以，應該尋求能與 NDM-1 以抑制劑結合的方式結合的微分子配基，并與 β-內酰胺類抗生素聯合使用，達到抗菌效果。

小結抗細菌潛在新作用靶點的作用機制及其抑制劑，并歸納于表 1 中。

3 抗病毒、抗腫瘤藥物作用新靶點

逆轉錄酶（RT）是 HIV 復制過程中不可或缺的，通過設計與 RT 結合的微型化合物，篩選能抑制 RT 活性的化合物，從而達到抗病毒的功效[8]。

HIV 復制期，逆轉錄酶（RT）具有兩種活性：一是相當于聚合酶參與病毒 RNA 逆轉錄合成DNA；二是相當于核糖核酸酶降解親代 RNA 逆轉錄合成的 DNA。RT 的這兩種功能活性在 HIV復制期間是必不可少的。目前已知的RT 抑制劑，大多是抑制 RT 聚合活性，而不是抑制 RT 的降解活性。另外，加上 HIV 的經常性變異，RT 的 RNase H 功能區在抗病毒藥物研究中將是個誘人的藥物靶點。

4 結論

由于細菌表現快速增長和緩慢增長、增殖和不增殖等多種生活特性，臨床上許多抗生素對真菌、細菌感染疾病的作用持續下降，并且通常存在一定的毒副作用。真菌、細菌的耐藥性與抗生素功效的局限性越來越成為挑戰。探索新的藥物作用靶點，研制新穎的高效、安全的抗菌藥物成了當今的迫切要求?？上驳氖?，目前該領域的研究正在持續深入，相信不久的將來會有更多高效低毒的新型抗生素問世。

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