大蒜素對脂多糖誘導的大鼠肺組織水通道蛋白-1表達的影響*

陳華文 馮 俊△ 易旻曉 祝 偉 李樹生

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學同濟醫學院第二臨床學院，湖北 武漢 430030）

急性肺損傷（ALI）是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，目前其發病機制尚未完全闡明。研究表明水通道蛋白-1（AQP-1）與肺水腫有關，AQP-1對于維持血管與間質之間水運動的平衡有重大意義［1］。大蒜素為植物大蒜中的重要活性成分，其對多種微生物具有強大的抑制和殺滅作用，實驗研究發現大蒜素對脂多糖（LPS）致膿毒癥急性肺損傷具有保護作用［2］。本研究主要觀察脂多糖致大鼠ALI時AQP-1表達的變化情況，并給予大蒜素干預，探討大蒜素對脂多糖誘導的急性肺損傷的具體機制，以期為治療膿毒癥提供更充分的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 內毒素（EscHErichiacoh055：B5，L2880美國 Sigma公司），抗 AQP-1 抗體（chemicon 公司）；SP試劑盒和DA B顯色試劑盒、大蒜素（武漢博士德生物技術有限公司）；Trizol提取液（15596-026美國Gibco-BRL公司），RT-PCR試劑盒 （大連寶生物公司），PCR引物（上海生物工程有限公司合成）。

1.2 動物與分組 成年SPF級雄性SD大鼠30只，體質量220～250 g，8～10周齡，由同濟醫學院動物中心提供。按隨機數字表隨機分為LPS組、大蒜素組和對照組，每組10只。

1.3 造模及給藥 通過鼠尾靜脈注射LPS復制內毒素大鼠模型。LPS組和大蒜素組給予LPS 5 mg/kg，用生理鹽水稀釋至2 mL靜脈注射，對照組給予生理鹽水2 mL靜脈注射。造模成功后，大蒜素組立即給予大蒜素20 mg/kg，用生理鹽水稀釋至2 mL靜脈注射，LPS組和對照組給予生理鹽水2 mL靜脈注射。

1.4 標本采集與檢測 分別在用藥后6 h時間點隨機快速處死大鼠，取右肺葉作病理切片備用；另取右中肺組織放入裝有RNA保護液的凍存管內迅速置于-80℃冰箱保存備用。（1）病理學檢測：取大鼠肺組織，10%中性甲醛固定，脫水后常規石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色，普通光學顯微鏡400倍下觀察肺組織病理學變化。（2）免疫組化法檢測肺組織AQP蛋白分布：采用SP法，切片經常規脫蠟、水化后，用3% 過氧化氫去除內源性氧化酶，微波抗原修復，余步驟按試劑盒說明書進行。用已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。AQP-1抗體稀釋濃度為1∶400。細胞胞質呈棕黃色著染者為陽性表達細胞。（3）實時定量PCR檢測肺組織AQPsmRNA表達：取右肺中葉組織，采用TRIzol試劑參照說明書提取總RNA，取2 μg RNA逆轉錄合成cDNA，其中2 μL cDNA為模板擴增，肌動蛋白β-actin為內參照，并設陰性對照。反應條件相同。AQP-1 引物序列：Forward primer（5′-3′）5′-CTGGCCTTTGGTTTGAGCAT-3′；Reverse primer（5′-3′）5′-CCACACACTGGGCGATGAT′；β-actin 引物序列：Forward primer （5′-3′）5′-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3′；Reverse primer （5′-3′）5′-TGGATGCCACAGGATTCCAT-3′。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，多個樣本均數比較采用方差分析及q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學結果 鏡下所示對照組肺組織結構正常。LPS組可見肺組織彌漫性中性粒細胞浸潤，肺泡腔變窄，肺泡壁增厚，肺間質充血水腫明顯，部分肺泡融合。大蒜素組中性粒細胞浸潤有所減輕，肺間質水腫減輕。

2.2 各組大鼠肺組織AQP-1蛋白表達 對照組正常肺組織表達高水平AQP-1蛋白，染色呈棕黃色顆粒，可見在氣道周圍毛細血管和肺泡毛細血管內皮細胞上呈明顯棕黃色分布。LPS組肺組織AQP-1蛋白表達顯著下降，大蒜素組肺組織AQP-1蛋白表達較LPS組升高，但仍低于正常水平。見表1。

表1 各組肺組織AQP-1免疫組化染色結果比較（）

表1 各組肺組織AQP-1免疫組化染色結果比較（）

與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，△P＜0.05。下同。

2.3 各組大鼠肺組織AQP-1 mRNA的表達 見表2。與對照組比較，LPS組肺組織AQP-1mRNA表達明顯降低（P<0.05），大蒜素干預后，肺組織AQP-1蛋白表達較LPS組升高，但仍低于正常水平（P<0.05）。

表2 各組肺組織中AQP-1 mRNA表達比較（）

表2 各組肺組織中AQP-1 mRNA表達比較（）

3 討 論

ALI發病機制十分復雜，肺泡內液體清除障礙是重要發生機制之一。在肺組織肺泡內水的轉運主要有兩條途徑，一是伴鈉的主動轉運，二是經肺泡上皮的水通道蛋白（AQPs）。研究表明，AQPs與肺水腫有關，是一組與水通透性有關的細胞膜轉運蛋白，它的發現在分子水平揭示了水跨膜轉運調節的基本機制，分布于肺組織中的AQPs有6種，AQPs組織分布的顯著特點為同一細胞定位上沒有兩種以上AQPs重疊分布［2］。AQP-1主要在氣道周圍毛細血管、淋巴管及肺泡毛細血管內皮細胞和臟層胸膜間皮細胞上表達，主要負責清除支氣管和脈管周圍組織的內水分［3］，各種肺損傷常伴有肺水腫的發生，而肺水腫以肺泡和間質內液體積聚為特點，發生時必然伴有水轉運紊亂及AQPs質或量的改變。研究發現AQP-1表達下降會導致跨細胞水轉運的速率降低，從而影響水腫液吸收，加重肺泡和間質水腫，從而加重其肺組織的病理性改變［4-5］。已有研究證實，在靜脈注射LPS致ALI模型中，以LPS 4 mg/kg劑量可以達到理想效果，并且4～12 h出現明顯肺水腫，檢測肺泡毛細血管內皮AQP-1蛋白表達數量明顯減少［6］，本實驗觀察到觀察到注射LPS后可迅速下調肺組織AQP1基因的表達，與雷賢英等［7］實驗結果一致。

大蒜素化學名稱為二烯丙基三硫，有較強的抗炎、抗氧化及清除氧自由基的作用［8-9］，對LPS導致的小鼠ALI具有防治作用，其機理與其能降低炎癥因子水平有關。本研究發現，應用大蒜素的治療組較LPS組肺組織AQP-1的蛋白和mRNA的表達均明顯升高，同時HE染色病理學檢查表明肺組織損傷明顯減輕，表明大蒜素對內毒素血癥時肺尤其是內毒素血癥早期具有保護效應，且其機制可能與調節肺組織AQP-1的表達有關，AQP-1在調節肺內液體平衡中起到明顯作用，可能參與了ALI肺水腫的發病機制，大蒜素可能通過干預AQP-1的表達改善膿毒癥肺損傷的病理變化。

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