人臍帶間充質干細胞注射液的長期穩定性研究

耿潔，張磊，王斌，韓忠朝

近年來隨著干細胞研究的快速發展，干細胞逐漸在醫學領域得到廣泛應用。為適應臨床使用的需要，各種干細胞制品制劑諸如新鮮制劑、凍存制劑、凝膠劑、組織工程細胞裝置相繼被開發。美國、加拿大、韓國的一些干細胞藥物相繼完成臨床前研究進入臨床試驗階段，這些都標志著干細胞從實驗室技術向著藥物的方向發展。干細胞向藥物轉化過程中的藥學研究是藥物安全性和有效性的基礎，參照藥物研發技術規范進行干細胞藥物制劑穩定性的研究是非常重要的一部分[1]。

藥物穩定性是指藥物在生產制備后，經過運輸、儲藏、周轉直至臨床應用前一系列過程中質量變化的程度。穩定性研究的目的在于查明一種藥品是怎樣作為時間函數和在各種不同環境因素影響下的不同表現，為藥品輔料的篩選，生產工藝、生產條件、包裝材料的選擇和有效期的確定提供必不可少的科學依據。干細胞凍存制劑，是將一定濃度的干細胞懸液與細胞凍存保護液按比例混合配制，分裝于適宜冷凍的內包裝材料中，放于液氮中保存的制劑。作為一種不同于傳統藥物制劑的全新藥物制劑形式，具有非常強的特殊性，更需要通過全面的穩定性研究來指導制劑的開發、制備、儲存、運輸、使用等[2]。

我們開發的新藥“注射用間充質干細胞（臍帶）”已完成了臨床前研究，進入臨床試驗審批階段。在藥學研究過程中，我們開發建立了一整套適用于間充質干細胞凍存制劑的質量檢測方法及標準。

本研究的目的是考察干細胞制劑在液氮凍存條件下物理、化學、生物學功能、微生物學等性質隨時間變化的規律，為干細胞藥品的生產、包裝、貯存、運輸條件和有效期的確定提供科學依據，以保障臨床用藥安全有效[3]。與傳統藥物制劑相比，干細胞藥品有一個突出特點即制劑的有效成分是活細胞。因此在穩定性考察的過程中將重點考察保存環境對活細胞的生物學活性的影響，為保證制劑中活細胞的生物學活性長時間穩定，制劑的保存溫度被設定在–196 ℃。這一保存溫度也是首次應用于藥物制劑開發中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與培養基、試劑 細胞制劑由本公司制備，含有 2×107個/袋的細胞懸液（含凍存保護劑）經超低溫凍存制備得到的；胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；DF12 培養基購自美國 Gibco公司；Human TNFRI Immuno Assay Kit 購自R & D公司；定量檢測牛血清白蛋白（BSA）酶聯免疫試劑盒購自無錫博生醫用生物技術開發有限公司。

1.1.2 儀器 FACS Calibur 型流式細胞儀購自美國 BD公司；SevenEasy 型 pH 計購自梅特勒-托利多公司；Model 680 酶標儀購自美國 Bio-Rad公司。

1.2 方法

選擇研發過程中中試規模制備的3 批制劑，定期取樣進行物理、化學、生物學功能、微生物學、外源添加物殘留量分析，以考察其穩定性變化趨勢。

1.2.1 外觀 在燈檢箱中采用目檢法進行外觀檢查。雙手持袋，輕輕旋轉或翻轉容器，注意不使液體產生氣泡。判定標準為均勻白色或略帶黃色半透明細胞混懸液，不應有搖不散的絮狀物，無異物。

1.2.2 pH 值 將待檢樣品復蘇后取出，平衡至室溫后按《中華人民共和國藥典》2010年版第三部附錄 VA 進行，判定標準為6.5～8.0。

1.2.3 細胞活率 使用 37～40 ℃ 溫水迅速復蘇融化待檢制劑，采用臺盼藍拒染法進行細胞存活率測定。判定標準為不低于80%。

1.2.4 細胞表型純度 將制劑中復蘇得到的細胞接種至T-75培養瓶中，并使用含有 10% 胎牛血清的DF12 進行培養，待細胞生長至 90% 融合后，消化獲取細胞懸液，使用熒光抗體對細胞進行表面標記，而后采用流式細胞儀測定細胞表型。判定標準為CD73、CD90和CD105 陽性率不低于95%；CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α/CD19和HLA-DR 陽性率不高于2%[4]。

1.2.5 生物學效力 將制劑中復蘇得到的細胞接種至T75培養瓶中，并使用含有 10% 胎牛血清的DF12 進行培養，待細胞生長至 90% 融合后，消化獲取細胞懸液，計數細胞總數，500×g 離心 10 min，棄上清獲取細胞，加入 RIPA 裂解液，制備得到濃度為1×107個/ml的細胞裂解液。而后使用 TNFRI ELISA Kit 對裂解物中 TNFRI進行檢測。該方法采用 ELISA 法檢查細胞中 TNFRI 表達水平，判定標準為間充質干細胞生物學效力應不小于13 pg/百萬細胞。

1.2.6 內毒素 按《中華人民共和國藥典》2010年版第三部附錄 XIIE 進行，判定標準為細菌內毒素的含量應不高于2 EU/ml。

1.2.7 無菌 按《中華人民共和國藥典》2010年版第三部附錄 XIIA 進行，結果應為陰性。

1.2.8 牛血清殘留量 將細胞制劑復蘇后取樣，使用“定量檢測牛血清白蛋白（BSA）酶聯免疫試劑盒”，對細胞懸液的牛血清殘留量進行檢測。每次檢測同時進行試驗有效性確認。判定標準為每個制劑牛血清殘留量不高于50 ng。

2 結果

2.1 外觀

結果表明，樣品在12、24、36個月的時間內制劑外觀始終保持穩定，未出現結團、絮狀物等現象。

2.2 pH 值

結果（表1）表明，樣品的pH 值在12、24、36個月時間內，保持穩定。

表1 pH的穩定性

2.3 細胞活率

使用配對 t 檢驗對數據進行統計學分析，分析保存時間對細胞活率所產生的影響是否具有統計學意義。結果（圖 1）顯示各個檢測點的數據與0 月相比，均 P ＞0.05。表明截至 36個月，在超低溫環境下的長期保存對制劑的細胞活率產生的影響均無統計學意義。

圖1 細胞活率變化趨勢

圖2 流式細胞檢測結果（A：R200910C001，0個月數據；B：R200910C001，36個月數據）

2.4 細胞表型純度

結果（圖 2）表明，同一批次細胞經過 36個月凍存，復蘇后其特征表型未發生變化。

2.5 生物學效力

樣品在12、24、36個月的時間內制劑的生物學效力檢測結果均在檢測限度內。

2.6 細菌內毒素

樣品在12、24、36個月的時間內制劑的內毒素情況始終保持穩定，各時間樣品均小于2 EU/ml，在限度檢測中未出現結果的變化。

2.7 無菌

樣品在12、24、36個月的時間內制劑的無菌檢查結果始終保持穩定。

2.8 牛血清殘留量

在36個月時間內，制劑中牛血清殘留量均不大于50 ng/劑量，保持穩定，如表 2 所示。

表2 牛血清殘留量（ng/劑量）

3 討論

3.1 儲存條件的選擇

本研究所檢測的樣品為具有生物學活性的干細胞，干細胞發揮疾病治療功效依賴于具有生物學活性的活細胞。在臨床應用過程中，常規條件保存新鮮制備的細胞制劑有效期短，無法長時間保存，即使是在4 ℃ 環境下儲運的干細胞制劑也無法長時間保持細胞活率的穩定。細胞活率在制備后幾十個小時內會隨著儲存時間的延長而顯著下降，導致制劑中活細胞的不斷減少，而細胞的死亡就意味著治療功效的喪失。這一問題嚴重制約了干細胞的臨床應用。一種無法長時間穩定保存的制劑是無法實現大規模標準化制備，往往在應用時無法準確獲得檢測結果，這將極大地降低其質量的可控性，進而增加安全性風險。細胞的超低溫凍存技術是一項已被醫學生物學研究領域應用多年且成熟的細胞保存技術。如今隨著干細胞引領的再生醫學的發展，這項技術將被應用于干細胞藥物的開發中。

要使干細胞制劑得以長時間保存，必須提供一個穩定的適宜的溫度環境。冷凍保存溫度的選擇成為了關鍵。冷凍保存溫度指能長期保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應極其緩慢甚至停止，但經過長期保存，在復蘇后仍能保持正常的結構和功能。不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同。但從實際和效益的觀點出發，液氮溫度（–196 ℃）是目前最佳的冷凍保存溫度。在–196 ℃ 時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復蘇后細胞的結構和功能完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在–196 ℃ 下均可保存十年以上。干細胞凍存制劑是儲存在超低溫環境下的特殊生物制劑。液氮提供的–196 ℃的超低溫環境對于干細胞凍存制劑的儲存是十分關鍵而且必需的。只有在超低溫環境下細胞才能被有活性的長期保存，并可以通過適宜的方法復蘇得到完整的活細胞并用于治療。

3.2 理化指標

在檢測數據中 pH 值和外觀這兩項理化指標在為期36個月的觀察中沒有出現異常。外觀并沒有隨著儲存時間的延長出現變化也沒有表現出某種變化的趨勢。由此證明在36個月的儲存過程中，現有的保存條件下保持制劑外觀具有很好的穩定性。pH 作為一個可以量化的指標，通過統計學分析表明制劑的pH 值未出現隨時間而變化的趨勢。從檢測數據本身來看，同一批號制劑前后多次檢驗時 pH 值表現出的差異為檢測隨機誤差造成，這種差異無明顯趨勢。

3.3 細胞表型純度

間充質干細胞表面表達多種特征分子，這些分子可以作為干細胞的特征，通過基于熒光抗體檢測技術的流式細胞術進行定量測定以獲取細胞純度的數據。但目前尚無一種特異性細胞表面分子可以單獨用于干細胞的鑒定及純度的測定，因此目前世界公認的標準為使用 8 種細胞表面分子組合用于干細胞的純度測定，純化后的間充質干細胞應同時滿足8個表面分子的純度指標：CD73、CD90和CD105 陽性率不低于95%；CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α/CD19和HLA-DR 陽性率不高于2%。本文選取 CD73、CD45和HLA-DR的結果。

3.4 微生物學指標

微生物學指標為無菌檢查和細菌內毒素檢查。通過實驗發現每一批次制劑的無菌、內毒素檢測結果在跨越 36個月的4 次檢測中結果前后一致?？梢娭苿┑臒o菌、內毒素在此次穩定性考查期間其限度檢測結果是穩定的，同時表明內包裝材料在–196 ℃ 環境下，能夠保持足夠的機械強度和密閉性。

3.5 生物學活性指標

首先是細胞活率，需要指出的是作為目前生物學研究領域內公認的細胞活率檢測方法——臺盼藍拒染法是有一定的檢測誤差的。在《生物制品質量控制分析方法驗證技術評審一般原則》[5]中指出，生物學檢測方法的標準差通常在±20% 之間，臺盼藍拒染法也存在同樣的特點，這一點和很多物理化學檢測方法有很大的不同，因此可以看到同一批制劑基于臺盼藍拒染法檢測得到的細胞活率數據前后有一些變化，這種變化是由于方法學本身特點造成的，因此我們在本次研究中選用了初始細胞活率不同的3 批樣品進行研究，以求通過增加樣本量獲取更為準確的檢測結論。通過統計學方法對細胞活率數據的分析，可以得出如下結論：在時間跨度 36個月的檢測中，3 批制劑總體上未表現出細胞活率隨著時間而降低的趨勢，也就是說制劑超低溫保存過程中的細胞活率是穩定的。

其次是細胞純度。臍帶間充質干細胞是一種從臍帶組織中通過分離并在體外培養過程中純化得到的干細胞。但在純化的過程中依靠現有的技術方法尚無法完全清除非干細胞的其他細胞，因此制劑中干細胞純度檢測也成為了衡量制劑生物學活性的重要指標。通過實驗發現，在經過了 36個月的儲存后，全部 3 批制劑中的干細胞純度仍然是合格的。

3.6 生物學效力指標

本研究中的生物學效力是根據臨床適應證的需要而進行的。由于干細胞的多向分化能力，在臨床應用時表現出針對不同的適應證的療效。本研究通過檢測腫瘤壞死因子受體 1（TNFRI）來評估其免疫調節的作用。同樣的，根據其他適應證例如促進血管新生、支持造血、促進皮膚修復等功能，應更新生物學效力的檢測方法。

大量的研究已經證明 MSC 具有免疫抑制活性，MSC可以遷移至損傷或炎癥部位，抑制 T 淋巴細胞的活性，同時抑制炎癥預激因子（如 TNF-α、IFN-γ），發揮組織修復作用[6]。

依據 MSC的免疫抑制作用，我們進行了淋巴細胞增殖抑制試驗，發現共培養體系中 MSC的數量與所產生的T 細胞增殖抑制作用之間存在明確的量效關系[7]。但是該檢測方法存在著操作環節多、具有放射性污染、技術難度大、實驗周期長、外周血細胞和MSC 消耗量大、所用新鮮人外周血批次差異大等缺點，造成檢測結果不穩定，重復性差，無法有效測定 MSC的生物學效力。由于MSC 表達的腫瘤壞死因子受體 1（TNFRI）可接受 TNF-α的刺激信號進而誘導 MSC 分泌 PGE2等免疫抑制因子，最終抑制 T 細胞增殖[8]，用 ELISA 法檢測 MSC的TNFRI 表達水平理論上可以間接地代表 MSC的免疫抑制效果。經驗證，ELISA 法檢測干細胞表面 TNFRI 表達量與間充質干細胞免疫調節的能力強弱具有一定的相關性，作為MSC 生物學效力測定方法，其線性、范圍、精密度、準確度、專屬性、耐用性均滿足接受標準。

3.7 添加物質的殘留量

牛血清是間充質干細胞培養過程中培養基的添加物質，在研究中堅持少加甚至不加的原則，但是目前階段本研究采用逐步減量的工藝。雖然在傳代的后期不使用牛血清，但是傳代前期使用的血清不可避免地殘留在制備細胞懸液中，因此在制備細胞制劑時，要嚴格控制牛血清的殘留量。

添加物質的殘留量分析是考察制劑穩定性的關鍵指標，隨著保存時間的延長，添加物質應保持一定的水平。本研究中，經過 36個月的保存，牛血清的殘留量仍然控制在一定范圍內，較為穩定。

綜上所述，我們所制備并用于本研究的間充質干細胞凍存制劑在–196 ℃的儲存環境下，包括理化、微生物學、生物學活性、添加物質殘留量的各項檢測指標均保持穩定，未出現明顯異常，也未表現出顯著的變化趨勢，可見此干細胞凍存制劑在超低溫環境下可以獲得非常穩定的保存而不出現任何影響到制劑質量的明顯變化。這為干細胞凍存制劑有效期的制訂提供了重要的依據，也提示我們此項穩定性研究可以繼續進行并積累更多的數據，以證明此制劑在超低溫環境下可以獲得更長的保存期。

目前已完成制劑保存 36個月的研究，更長時間的穩定性研究后續正在進行。

[1]The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use.ICH harmonised tripartite guideline -- 2007 part quality.Zhou HJ,interpret.Beijing: People’s Medical Publishing House, 2006.(in Chinese)ICH指導委員會.藥品注冊的國際技術要求——2007質量部分.周海鈞, 譯.北京:人民衛生出版社, 2006.

[2]China Food and Drug Administration.Technical guideline on research and quality control of human somatic cell therapy products.(2003-03-20) [2013-01-05].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0237/15709.html.(in Chinese)國家食品藥品監督管理局.人體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則.(2003-03-20) [2013-01-05].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0237/15709.html.

[3]China Food and Drug Administration.Guideline for stability testing of drug substances.(2005-03) [2013-01-02].http://www.sda.gov.cn/gsz 05106/01.pdf.(in Chinese)國家食品藥品監督管理局.化學藥物穩定性研究技術指導原則.(2005-03) [2013-01-02].http://www.sda.gov.cn/gsz05106/01.pdf.

[4]Dominici M，Le Blanc K, Mueller I, et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy, 2006,8(4):315-317.

[5]China Food and Drug Administration.General principles for biological products quality control method validation.(2005-12)[2013-01-02].http://wenku.baidu.com/view/552092659b6648d7c1c746f7.html.(in Chinese)國家食品藥品監督管理局.生物制品質量控制分析方法驗證技術評審一般原則.(2005-12) [2013-01-02].http://wenku.baidu.com/view/552092659b6648d7c1c746f7.html.

[6]Liu RY, Fan C, Mitchell S, et al.The role of type I and type II tumor necrosis factor (TNF) receptors in the ability of TNF-alpha to transduce a proliferative signal in the human megakaryoblastic leukemic cell line Mo7e.Cancer Res, 1998, 58(10):2217-2223.

[7]Di Nicola M, Carlo-Stella C, Magni M, et al.Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or non-speci fi c mitogenic stimuli.Blood, 2002, 99(10):3838-3843.

[8]Aggarwal S, Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses.Blood, 2005, 105(4):1815-1822.