滸苔干粉末提取物對東海原甲藻和中肋骨條藻的克生作用

韓秀榮，高 嵩，侯俊妮，李鴻妹，石曉勇，3，*

(1.中國海洋大學化學化工學院，青島 266100;2.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，青島 266100;3.國家海洋局減災中心，北京 100194)

在海洋生態系統中，大型藻類對防止水體富營養化，凈化水體起著重要的作用［1］，是海洋生態系統極其重要的生物調節因子［2］。另外，很多大型藻類都能向海洋分泌釋放出多種次級代謝產物，其中包括不飽和脂肪酸、糖苷、硫化物、多酚、以及萜類等化合物［3］。這些化合物在海洋生態系統中承擔著十分重要的角色［4-5］。這些大型藻類產生的次級代謝產物通常具有某些特殊的化學結構及生理功能，對海洋生態系統的其他藻類起到一定的克生作用［6-11］。目前針對海洋中大型藻體內克生物質的提取、分離以及鑒定和這些克生物質在實際中的應用已經成為海洋生態環境研究的熱點問題之一［4，12-17］。

近年來綠潮災害在我國多次暴發，給沿海經濟的發展及人們的生活造成了很大影響。自2007年在黃海海域首次出現小規模綠潮之后，2008—2012年又連續暴發大規模綠潮［18-21］。作為黃海海域綠潮的主要藻種－滸苔，目前對其次級代謝產物的提取與應用的研究較少。

本研究通過不同極性的溶劑對滸苔干粉末進行萃取，收集提取物。并以東海原甲藻及中肋骨條藻為實驗對象，用不同溶劑的滸苔提取物，在不同濃度的添加情況下，分別研究對這兩種赤潮藻生長的克生作用。通過在不同條件下對這兩種常見赤潮藻生長克生作用的分析，為滸苔藻體內克生物質的分離、鑒定以及利用提供一定的科學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 滸苔

實驗所用的滸苔均采自青島沿海，滸苔采集后除去雜藻，用經醋酸纖維濾膜(孔徑0.45μm)過濾后的滅菌(120℃，20 min)海水反復清洗，以除去藻體中泥沙及其它雜物。將其培養于已滅菌(120℃，20 min)的錐形瓶中，用滅菌海水配置的f/2培養液進行培養。培養溫度為(20±1)℃;光照強度為4000 lx;光照周期為L∶D=12 h∶12 h。每天定時晃動培養瓶，每隔3d更換新的培養液。

培養若干天后從培養瓶中挑選生長良好的滸苔藻體，用滅菌海水沖洗4—5次，然后用滅菌濾紙吸干藻體表面的水分，在常溫下干燥5d左右(期間對藻體進行多次稱量，以確定干燥完全至恒重，干濕比約為1∶4.4)，然后用瑪瑙研缽研磨成粉末，過篩(粒徑小于0.2 mm)待用。

1.1.2 赤潮藻

實驗用的東海原甲藻和中肋骨條藻均取自中國海洋大學海洋污染生態化學重點實驗室藻種室，培養介質與培養條件與1.1.1中滸苔藻體一致。

1.2 滸苔干粉末提取物的制備

1.2.1 蒸餾水提取物

稱取10.0 g上述滸苔干粉末放置于500 mL錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水，搖晃均勻。常溫下用超聲波法提取2 h，靜置12 h。常溫下再用超聲波法提取2 h，然后用離心機分離(7500 r/min，15 min)，收集上層的提取液。下層粉末殘渣再按上述方法提取1次，合并兩次上層提取液。將收集的提取液用旋轉蒸發儀減壓蒸干，獲得淡綠色膏狀物質，加入蒸餾水后定容至25.00 mL，此時濃度以400 g/L表示(即400 g滸苔干粉末組織提取物溶于1 L蒸餾水中)，最后置于冰箱冷藏(4℃)備用。

1.2.2 有機溶劑提取物的制備

選用3種極性不同的有機溶劑:甲醇、乙酸乙酯、正己烷(極性由高至低)，分別對5.0 g滸苔干粉末進行提取，得到相應的提取物。提取方法及條件與1.2.1中蒸餾水提取一致。然后分別將所得提取物用二甲基亞砜Dimethy lsulfoxide(DMSO)定容至10 mL，濃度以500 g/L表示(即500 g滸苔干粉末組織提取物溶于1 L有機溶劑中)，置于冰箱冷藏(4℃)備用。

1.3 實驗方法

實驗在室內的光照培養箱內進行，培養條件同1.1.1中滸苔培養條件一致。每天定時晃動培養瓶兩次，防止赤潮藻貼壁生長。為降低光照條件對實驗的影響，每兩天將培養瓶進行位置互換。

1.3.1 溶劑檢驗實驗

將梯度為 0，1，5，10，20，25，50，100，200 μL 的 DMSO 分別加入到 100 mL 錐形瓶中，然后加入 f/2 培養液以及兩種赤潮藻的藻液，混合液的總體積為 20 mL，濃度梯度分別為 0，0.05，0.25，0.50，1.00，1.25，2.50，5.00，10.00 g/L。其中東海原甲藻和中肋骨條藻的接種密度均為5.5×104個/mL。各實驗均平行進行3組，實驗周期為9 d。

1.3.2 蒸餾水提取物對兩種赤潮藻生長的影響

將預先制備好的滸苔干粉末的蒸餾水提取物(濃度 400 g/L)以梯度為 0，0.06，0.12，0.25，0.50，1.00 mL分別加入到100 mL錐形瓶中，然后加入f/2培養液以及兩種赤潮藻的藻液，混合液的總體積為20 mL?；旌弦褐袧G苔干粉末的蒸餾水提取物的濃度梯度分別為 0，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 g/L。東海原甲藻和中肋骨條藻的接種密度均為5.5×104個/mL。各實驗均平行進行3組，實驗周期為9 d。

1.3.3 有機溶劑提取物對兩種赤潮藻生長的影響

將預先制備好的滸苔干粉末的有機溶劑提取物(濃度500 g/L)以梯度為 0，1，5，10，20，25，50，100 μL分別加入到100 mL錐形瓶中，然后加入f/2培養液以及兩種赤潮藻的藻液，混合液的總體積為20 mL?；旌弦褐袧G苔干粉末的有機溶劑提取物的濃度梯度分別為 0，0.03，0.13，0.25，0.5，0.63，1.25，2.50 g/L。東海原甲藻和中肋骨條藻的接種密度也均為5.5×104個/mL。各實驗均平行進行3組，實驗周期為9 d。

1.4 數據處理及統計分析

1.4.1 赤潮藻的日平均生長率、抑制率P'與半效應濃度EC50

每天的固定時間用光學顯微鏡，采用浮游生物計數框的計數方法得出赤潮藻的細胞密度。赤潮藻的日平均生長率(υs，%/d)的計算公式如下:

式中，N0和Nt分別是實驗開始和實驗進行到第t天時的赤潮藻的細胞密度。

表1 滸苔對赤潮藻克生作用實驗中所設置的實驗條件Table 1 The experimental conditions in the assays for the effects of Enteromorpha on red-tide microalgae

抑制率P'(%)的計算公式如下:

式中，B0-control為對照組赤潮藻的起始藻種密度;Bt-control為對照組的赤潮藻t時刻的藻種密度。Bt為實驗組的赤潮藻t時刻的藻種密度。

EC50是指在一定時間內(如72 h，96 h等)，浮游植物的相對生長率減少50%時毒性物質的濃度。EC50的值越小，說明毒性越大。EC50能夠簡單、明確的表示物質對浮游植物的生物毒性，因此在生物毒性學中是一個重要的參數，并得到了廣泛應用。本研究半效應濃度EC50值采用內插直線法計算，為72 h的EC50值。

1.4.2 數據統計分析

采用SPSS16.0軟件對實驗數據進行獨立樣本檢驗統計分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 溶劑DMSO檢驗結果

不同的DMSO添加對東海原甲藻和中肋骨條藻兩種赤潮藻生長的影響如圖1所示。從圖中可以明顯看出，不同梯度添加DMSO的實驗組中的這兩種赤潮藻的生長曲線均與對照組(0 g/L DMSO添加量)呈現出相似的增長趨勢。由圖中可知中肋骨條藻的增長較東海原甲藻速度快，藻種密度平均高一個數量級。用軟件SPSS16.0對兩種赤潮藻實驗組和對照組的細胞密度進行t-test檢驗和F檢驗，結果表明這兩種赤潮藻的實驗組和對照組之間均沒有顯著性差異(P＞0.05)。說明溶劑DMSO對這兩種赤潮藻的生長不產生影響，以下實驗可以用該試劑進行實驗。

圖1 二甲基亞砜對東海原甲藻和中肋骨條藻生長的影響Fig.1 The effect of Dimethy lsulfoxide(DMSO)on Prorocentrum donghaiense and Skeletonema costatum

2.2 滸苔干粉末提取物對東海原甲藻生長的影響

滸苔干粉末的蒸餾水提取物對東海原甲藻生長的影響如圖2及表2所示。由圖2可知，與對照組(0 g/L添加)相比，較低濃度(1.25 g/L添加)的滸苔干粉末蒸餾水提取物對東海原甲藻的生長有促進作用。較高濃度(＞1.25 g/L的添加)的滸苔干粉末蒸餾水提取物對東海原甲藻的生長有抑制作用。也證實了對克生作用(Allelopathy)的定義:有利或有害的相互作用。其中由于克生物質濃度的不同，產生的作用也可能會不同，抑制或者促進生長。

圖2 添加了不同濃度滸苔干粉末提取物的東海原甲藻的生長曲線Fig.2 The growth of Prorocentrum donghaiense in the presence of different concentrations of extracts

由圖2可知，濃度為1.25 g/L的滸苔干粉末蒸餾水提取物的添加組中東海原甲藻較快的進入指數增長期，并且比對照組的生長更快。濃度為2.50 g/L的蒸餾水提取物的添加對東海原甲藻的生長有著明顯的抑制作用，在實驗過程中東海原甲藻的增長緩慢，始終沒有進入明顯的指數生長期。說明開始出現對東海原甲藻產生抑制作用的濃度在1.25 g/L與2.50 g/L之間，此外，蒸餾水提取物對東海原甲藻的72 h EC50值為1.79 g/L。推測滸苔干粉末蒸餾水提取物對東海原甲藻開始出現抑制作用的閾值濃度為1.50 g/L。濃度≥5.00 g/L的滸苔干粉末蒸餾水提取物對東海原甲藻有著極其顯著的抑制效應，東海原甲藻的藻體在3 d內全部死亡，具有短期致死效應。5.00、10.00、20.00 g/L的蒸餾水提取物物組的東海原甲藻的生長表現一致，說明5.00 g/L的蒸餾水提取物是影響東海原甲藻生長的致死作用閾值濃度，大于等于該值時對藻體表現為短期致死的效應。從表2中的抑制率可以得到同樣結果。

滸苔甲醇提取物對東海原甲藻生長的效應如圖2與表2所示。較低濃度(0.03 g/L)的滸苔甲醇提取物的添加與對照組相比，東海原甲藻的生長曲線基本一致，幾乎對藻體沒有影響。由表2所示，隨著提取物添加濃度的增大，東海原甲藻的生長受到的抑制作用逐漸顯著，抑制率逐漸增大，日平均生長率依次降低，實驗末東海原甲藻的藻密度減少。當添加濃度增至0.13 g/L時即表現出了對藻體相對明顯的抑制作用，藻體的指數增長期極不明顯。此外，滸苔甲醇提取物對東海原甲藻的72 h EC50值為0.16 g/L。由此推測滸苔甲醇蒸餾水提取物對東海原甲藻開始出現抑制作用的閾值濃度約為0.10 g/L。由圖2所示，當添加濃度為0.25 g/L時則對東海原甲藻的生長表現出了極其強的抑制作用，由表2得出此時藻體的日平均生長率僅為1%。當添加濃度≥0.50 g/L時則對東海原甲藻的生長產生強烈的致死效應，3 d內致使東海原甲藻藻體全部死亡。說明0.50 g/L的甲醇提取物添加是影響東海原甲藻生長的致死作用閾值濃度，大于等于該值時對藻體表現為短期致死的效應，從表2中的抑制率也可以得到同樣結果。

表2 滸苔干粉末不同溶劑提取物對東海原甲藻生長影響的比較Table 2 The effection of different solvent extracts of Enteromorpha on Prorocentrum donghaiense

滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻生長的效應如圖2所示。與滸苔甲醇提取物添加實驗中東海原甲藻生長曲線比較相似，同樣表現為較低濃度(0.03 g/L)時對東海原甲藻生長的影響不顯著。由表2所示藻體的日平均生長率以及實驗末的藻密度均與對照組基本相同。較高濃度添加時也與甲醇提取物添加實驗中東海原甲藻生長曲線比較相似。此外，滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻的72 h EC50值為0.14 g/L。由此推測滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻開始出現抑制作用的閾值濃度約為0.10 g/L。這與滸苔甲醇提取物對東海原甲藻的起始抑制濃度相近，此外，滸苔干粉末乙酸乙酯提取物添加影響東海原甲藻生長的致死作用閾值濃度與甲醇提取物相似，也為0.50 g/L。

滸苔正己烷提取物對東海原甲藻生長的效應如圖2所示。從圖中東海原甲藻的生長曲線可以看出，濃度為0.03 g/L的正己烷提取物添加和0.13 g/L的正己烷提取物添加對東海原甲藻的生長的影響作用較小。其中濃度為0.03 g/L的正己烷提取物添加對東海原甲藻的生長表現為較小的促進作用，濃度為0.13 g/L的正己烷提取物添加可對東海原甲藻產生則表現為不太顯著的抑制作用。濃度增至為0.25 g/L的正己烷提取物添加時，對東海原甲藻生長表現出較顯著的抑制作用。由表2所示，此時東海原甲藻的日平均生長率為48.8%，遠低于對照組東海原甲藻日平均生長率(131.7%)，但又遠遠超過0.25 g/L的甲醇或乙酸乙酯提取物添加的東海原甲藻的日平均生長率(1.0%和2.4%)。此外，滸苔正己烷提取物對東海原甲藻的72 h EC50值為0.24 g/L。綜上推測滸苔正己烷提取物對東海原甲藻開始出現抑制作用的閾值濃度約為0.15 g/L。當濃度為0.50 g/L滸苔正己烷提取物添加時，則對東海原甲藻的生長表現為強烈的抑制作用，生長極其緩慢。由表2得出此時藻體的日平均生長率僅為3.7%。當濃度為≥0.63 g/L的正己烷提取物添加時，則對東海原甲藻的生長產生強烈的致死效應，3 d內致使東海原甲藻藻體全部死亡，濃度高時則2 d內使藻體致死。說明0.63 g/L的正己烷提取物是影響東海原甲藻生長的致死作用閾值濃度。

綜上，并且由表2中所列不同極性溶劑的滸苔提取物添加時，東海原甲藻日均生長率及對其的抑制率等參數所示，可以看出各溶劑滸苔提取物對東海原甲藻生長作用有著明顯的差異。其中，蒸餾水的提取物需要較高的添加濃度才會對東海原甲藻的生長產生影響，說明蒸餾水的提取效果比有機溶劑差。濃度為0.03 g/L(約需新鮮滸苔藻體0.11 g濕重/L)有機溶劑提取物添加時東海原甲藻的生長有著輕微差異，其中甲醇和乙酸乙酯提取物對東海原甲藻的生長影響較小，與對照組相比有著極小的抑制作用;而此濃度正己烷提取物對東海原甲藻則表現為一定的促進作用。濃度較高的提取物添加則對東海原甲藻均表現為不同程度的抑制作用。蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷滸苔提取物影響東海原甲藻生長的致死作用閾值濃度分別為5.00、0.50、0.50、0.63 g/L(相當于滸苔新鮮藻體濃度為 22.00、2.20、2.20、2.75 g 濕重/L)。說明甲醇、乙酸乙酯的對滸苔干粉末的提取液對東海原甲藻的克生作用最為明顯，其次是正己烷，最差的是蒸餾水提取液。此外，由滸苔各個溶劑提取物對東海原甲藻的72 h EC50值能得出相同的結論。

2.3 滸苔干粉末提取物對中肋骨條藻生長的影響

圖3 添加了不同濃度滸苔干粉末提取物的中肋骨條藻的生長曲線Fig.3 The growth of Skeletonema costatum in the presence of different concentrations of extracts

滸苔干粉末的蒸餾水提取物對中肋骨條藻生長的影響如圖3及表3所示。從圖3的中肋骨條藻的生長曲線可以看出，與對照組(0 g/L添加)相比，較低濃度(1.25 g/L添加)的滸苔干粉末蒸餾水提取物對中肋骨條藻的生長幾乎沒有影響，兩條生長曲線基本一致。隨著提取物添加濃度的增加，可以看出中肋骨條藻的生長受到的抑制效應逐漸增大，并且梯度十分明顯。初步由表3可以看出日平均生長率降低，中肋骨條藻的日平均生長率由2.50 g/L添加濃度的795.0%降至10.00 g/L添加濃度的433.9%。由圖推測滸苔蒸餾水提取物對中肋骨條藻開始出現抑制作用的閾值濃度約為1.50 g/L。此外，由表3可知，滸苔蒸餾水提取物對中肋骨條藻的72 h EC50值為11.74 g/L。當濃度為20.00 g/L的蒸餾水提取物添加時，中肋骨條藻藻體在實驗1 d就被全部殺死。說明20.00 g/L的蒸餾水提取物添加是影響中肋骨條藻生長的致死作用閾值濃度，大于等于該值時對藻體表現為短期致死的效應。從表3中的抑制率可以得到同樣結果。

表3 滸苔干粉末不同溶劑提取物對中肋骨條藻生長影響的比較Table 3 The effection of different solvent extracts of Enteromorpha on Skeletonema costatum

滸苔甲醇提取物對中肋骨條藻生長的效應如圖3與表3所示。較低濃度(0.03 g/L)的滸苔甲醇提取物的添加與對照組相比，中肋骨條藻的生長曲線基本一致，此添加濃度對藻體生長的影響不顯著(P＞0.05)。由表3所示，隨著提取物添加濃度的增大，中肋骨條藻的生長受到的抑制作用逐漸顯著，且抑制率逐漸增大，日平均生長率依次降低。當添加濃度增至0.13 g/L時即表現出了對藻體有著不太明顯的抑制作用，藻體進入指數增長期不太明顯。由圖3推測滸苔蒸餾水提取物對中肋骨條藻開始出現抑制作用的閾值濃度約為0.10 g/L。此外，滸苔甲醇提取物對中肋骨條藻的72 h EC50值為0.22 g/L。由圖3可以看出，當濃度為0.25 g/L滸苔甲醇提取物的添加時則對中肋骨條藻的生長表現出了極其強的抑制作用，由表3得出此時中肋骨條藻藻體的日平均生長率僅為385.5%。遠小于對照組的1085.9%。為濃度0.50 g/L與0.63 g/L滸苔甲醇提取物的添加時則對中肋骨條藻的生長產生強烈的抑制效應，生長極其緩慢，藻體的日平均增長率分別為40.8%和10.4%。當添加濃度≥1.25 g/L時則對中肋骨條藻的生長產生強烈的致死效應，2 d內致使東海原甲藻藻體全部死亡。說明1.25 g/L的甲醇提取物添加是影響中肋骨條藻生長的致死作用閾值濃度，大于等于該值時對藻體表現為短期致死的效應。從表3中的抑制率也可以得到同樣結果。

滸苔乙酸乙酯提取物對中肋骨條藻生長的效應如圖3與表3所示。低濃度添加濃度(0.03 g/L)時與甲醇提取物對中肋骨條藻生長的影響程度相似，對中肋骨條藻生長的影響作用不明顯。濃度為0.13 g/L的滸苔的乙酸乙酯提取物對中肋骨條藻的生長有較明顯的抑制作用，從生長曲線可以看出進入指數增長期不是很明顯。由圖3推測滸苔乙酸乙酯提取物對中肋骨條藻開始出現抑制作用的閾值濃度也約為0.10 g/L。此外，滸苔乙酸乙酯提取物對中肋骨條藻的72 h EC50值為0.19 g/L。在0.25 g/L的濃度添加時抑制效果更加明顯，當增至0.50 g/L與0.63 g/L濃度的滸苔乙酸乙酯提取物添加時，對中肋骨條藻的生長產生極其強烈的抑制作用，使其無法正常自然生長，中肋骨條藻的日平均生長率分別為40.8%和6.1%。當濃度達1.25 g/L時，短期內即可使中肋骨條藻全部死亡。說明1.25 g/L的乙酸乙酯提取物添加是影響中肋骨條藻生長的致死作用閾值濃度，大于等于該值時對藻體表現為短期致死的效應。

滸苔正己烷提取物對中肋骨條藻生長的效應如圖3所示。從圖中中肋骨條藻的生長曲線可以看出，濃度為0.03 g/L的正己烷提取物添加對東海原甲藻的生長的影響作用較小，表現為較小的促進作用。濃度為0.13、0.25、0.50、0.63 g/L的滸苔正己烷提取物添加時東海原甲藻的生長曲線極其相似。表現為極小的抑制作用，從表3可得此時東海原甲藻的日均生長率分別為869.7%、844.8%、811.1%、801.6%，也對照組(0 g/L添加)的日均生長率1085.9%相差很小。由圖3推測滸苔正己烷提取物對中肋骨條藻開始出現抑制作用的閾值濃度約為0.15 g/L。此外，滸苔正己烷提取物對中肋骨條藻的72 h EC50值為0.81 g/L。濃度增至為1.25 g/L的正己烷提取物添加時，對中肋骨條藻生長表現出較顯著的抑制作用。由表3所示，此時中肋骨條藻的日平均生長率為415.8%，遠低于對照組中肋骨條藻的日平均生長率1085.9%。但與此濃度的甲醇或乙酸乙酯提取物添加對中肋骨條藻有短期致死的現象相比，滸苔正己烷提取物添加時中肋骨條藻的生長相對還是相對較快的。當濃度為2.50 g/L的正己烷提取物添加時，則對中肋骨條藻的生長產生強烈的致死效應，3 d內致使中肋骨條藻藻體全部死亡，濃度高時則2 d內致死。說明2.50 g/L的正己烷提取物添加是影響中肋骨條藻生長的致死作用閾值濃度。

綜上，并且由表3中所列不同溶劑的滸苔提取物添加時，中肋骨條藻日均生長率及對其的抑制率等參數所示，可以看出各溶劑滸苔提取物對中肋骨條藻生長作用有著明顯的差異。蒸餾水的提取物需要較高的添加濃度才會對中肋骨條藻的生長產生影響，說明蒸餾水的提取效果比有機溶劑差。這和東海原甲藻的實驗得出結果一致。濃度為0.03 g/L(約需滸苔的新鮮藻體0.11 g濕重/L干燥得到)有機溶劑提取物添加時中肋骨條藻的生長有著輕微差異，其中甲醇提取物對中肋骨條藻的生長影響較小，與對照組相比有著極小的抑制作用;而此濃度乙酸乙酯與正己烷提取物對中肋骨條藻則表現為一定的促進作用。此濃度時乙酸乙酯提取物對藻體的作用與東海原甲藻實驗表現有一定差異，甲醇與正己烷一致。濃度較高的提取物添加則對中肋骨條藻均表現為不同程度的抑制作用。蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷滸苔提取物影響中肋骨條藻生長的致死作用閾值濃度分別為 20.00、1.25、1.25、2.50 g/L(相當于滸苔新鮮藻體濃度為 88.00、5.50、5.50、11.00 g 濕重/L)。說明甲醇、乙酸乙酯的對滸苔干粉末的提取液對中肋骨條藻的克生作用最為明顯，其次是正己烷，最差的是蒸餾水提取液。與東海原甲藻實驗相對比，各種溶劑提取物對中肋骨條藻的致死作用閾值濃度較大。此外，由滸苔各個溶劑提取物對中肋骨條藻的72 h EC50值的對比能得出相同的結論。

2.4 不同溶劑提取物對兩種赤潮藻克生作用的比較

不同溶劑提取物在不同濃度添加時對兩種赤潮藻72 h抑制率的比較如圖4所示。從整體上可以明顯看出相同條件的提取物添加時，對東海原甲藻的72 h抑制率遠大于對中肋骨條藻的抑制率。并且高濃度(≥0.63 g/L)的有機溶劑提取物添加時，東海原甲藻3 d內均已死亡，無法算出72 h抑制率。

滸苔蒸餾水提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的克生作用差異較大。濃度為1.25 g/L的滸苔蒸餾水提取物添加對東海原甲藻的72 h抑制率為負值(－11.1%)，表現為較小的促進作用。而此濃度的蒸餾水提取物添加對中肋骨條藻的72 h抑制率為正值(6.0%)，表現為較小的抑制作用。濃度為2.50 g/L和2.50 g/L蒸餾水提取物提取物對這兩種赤潮藻的72 h抑制率均為正值且差異較大，對東海原甲藻的72 h抑制率約為中肋骨條藻的5倍。說明蒸餾水提取物對東海原甲藻的克生作用高于對中肋骨條藻的克生作用，主要表現為抑制作用。此外，由表3中的滸苔蒸餾水提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為1.79 g/L與11.74 g/L可得出一致的結論。

滸苔甲醇提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的抑制率如圖4所示。低濃度(0.03 g/L與0.13 g/L)滸苔甲醇提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h抑制率相近。高濃度(≥0.25 g/L)滸苔甲醇提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的抑制率的差異較大，隨著添加濃度的增大，對東海原甲藻的抑制率迅速增大，而對中肋骨條藻抑制率增大的趨勢相對緩和些。此外，由表3中的滸苔甲醇提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為0.16 g/L與0.22 g/L也可得滸苔甲醇提取物對東海原甲藻的抑制作用更顯著些。

圖4 不同溶劑提取物對兩種赤潮藻的72 h抑制率比較Fig.4 The inhibition of different solvent extracts of Enteromorpha on the two red tide microalgae

滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的克生作用在低濃度添加時表現為相反的現象。0.03 g/L濃度的滸苔乙酸乙酯提取物添加對東海原甲藻表現為較小的抑制作用，而對中肋骨條藻則表現為較小的促進作用。較高濃度的滸苔乙酸乙酯提取物，均隨著濃度的增加對兩種藻體的抑制率均隨著增大。同條件下的滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻的72 h抑制率比對中肋骨條藻的72 h抑制率要高。濃度為0.50 g/L的滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻的72 h抑制率迅速升高，說明已臨近藻種的致死作用閾值濃度。大于此濃度的滸苔乙酸乙酯提取物添加使東海原甲藻藻體迅速死亡，計算不出其72 h抑制率。說明滸苔乙酸乙酯提取物添加對東海原甲藻的克生作用遠大于對中肋骨條藻的克生作用，這與滸苔甲醇提取物的實驗結論一致。此外，由表3中的滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為0.14 g/L與0.19 g/L也可得滸苔乙酸乙酯提取物對東海原甲藻的抑制作用更顯著些。

滸苔正己烷提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的抑制率如圖4所示。低濃度(0.03 g/L)的滸苔正己烷提取物添加對東海原甲藻與中肋骨條藻的克生作用均表現為促進作用，對東海原甲藻的促進作用更為明顯。當滸苔正己烷提取物添加濃度的增加，對東海原甲藻的72 h抑制率迅速增加，濃度大于0.50 g/L時3 d內藻體全部死亡。而隨著滸苔正己烷提取物添加濃度的增加中肋骨條藻的72 h抑制率相對變化較小。其中，在添加濃度為0.13 g/L至0.63 g/L時72 h抑制率相對變化極小。當滸苔正己烷提取物添加濃度為1.25 g/L時中肋骨條藻的72 h抑制率迅速增大，說明此時已臨近其致死作用閾值濃度。從整體上分析，滸苔正己烷提取物添加對東海原甲藻的克生作用遠大于對中肋骨條藻的克生作用，這與滸苔甲醇提取物以及乙酸乙酯提取物的實驗結論相一致。此外，由表3中的滸苔正己烷提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為0.81 g/L與0.24 g/L也可得滸苔正己烷提取物對東海原甲藻的抑制作用更顯著些。

綜上所述，滸苔組織中確實含有能抑制或者促進兩種赤潮藻生長的克生物質，這與國外內的一些關于大型藻類的研究相一致。Jeong等［22］研究發現多種大型海藻的組織提取物對赤潮藻具有殺藻活性，發現一些綠藻、褐藻和紅藻組織的甲醇及蒸餾水提取物對一些典型的赤潮藻具有強烈的殺藻作用。大型海藻Myriophyllum spicatum能夠持續向海洋系統中分泌不穩定的化合物對藍藻生長具有一定的抑制作用［2］?；粼樱?3］等研究也發現滸苔新鮮組織內存在能抑制米氏凱倫藻的克生物質。賈睿［24］等人研究發現滸苔組織對赤潮異彎藻的生長具有一定的克生作用，滸苔干粉末與赤潮異彎藻的共生系統，干粉末濃度為1.6 g/L時對赤潮異彎藻產生明顯的抑制作用，可以初步推測共培養系統比滸苔提取物對赤潮藻的抑制效果更好，賈睿［24］等人還發現克生物質具有較高的極性，這與本研究的結論一致。此外，滸苔對赤潮異彎藻的致死作用閾值濃度比中肋骨條藻和東海原甲藻要低些。證明了滸苔對各種微藻生長的抑制作用各有差異，但起抑制作用的物質普遍均有較高的極性。

從抑制率數值上來看東海原甲藻與中肋骨條藻對各種溶劑提取物的敏感程度不同?？傮w來看，低濃度時，東海原甲藻與中肋骨條藻敏感程度相近;濃度稍高，東海原甲藻較中肋骨條藻敏感。這可能是由于東海原甲藻和中肋骨條藻細胞結構不同所致。由表3滸苔提取物對東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值來看，不同溶劑的滸苔提取物對東海原甲藻的抑制作用比中肋骨條藻要顯著些。另外，從圖4中可以很直觀的看出對這兩種藻克生作用的濃度效應，即濃度越大對其抑制作用越強，某些溶劑的提取物在低濃度情況下可以對藻體產生促進作用。王悠［6，25］等也報道了一些大型藻類對微藻的克生作用具有低促高抑的特點，并且有作用種屬的特異性。這也說明了滸苔對赤潮藻的抑制作用的特點都極其相似。

此外，克生物質的分離與提取研究相對較少。別聰聰等［26］人發現包括腸滸苔在內的大型藻對中肋骨條藻的抑制物質，主要包括9-十八炔、鄰苯二甲酸二異丁酯、17-烯十八醛等。具體哪種物質具有的抑制效果更顯著需進一步驗證。孫穎穎等［27］人研究分析克生物質是通過影響細胞蛋白質以及多糖的合成來抑制微藻的生長。

3 結論

本文探索和討論了4種不同溶劑(包括蒸餾水和甲醇、乙酸乙酯、正己烷3種有機溶劑)的滸苔干粉末提取物對東海原甲藻和中肋骨條藻生長的克生作用。實驗結果表明，滸苔提取物中確實含有可以影響這兩種赤潮藻類生長的克生物質，克生作用具有較明顯的濃度效應，濃度低時(0.03 g/L)可能會表現為一定的促進生長的作用，在較高的濃度時表現為抑制作用，隨著添加濃度增加，抑制作用變強，即表現出“低促高抑”的特點，這與滸苔對其他微藻生長的作用［24-27］相似。

蒸餾水提取物對兩種赤潮藻的克生作用小于有機溶劑提取物，在有機溶劑中，甲醇和乙酸乙酯提取物對藻體的克生效果最好，正己烷相對較差。根據相似相溶原則，可以初步斷定該類克生物質中最有效的成分應為具有相對較高極性的有機物。

兩種赤潮藻對克生物質的敏感程度不同，東海原甲藻對克生物質的敏感性高于中肋骨條藻。

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