代平顆粒對2 型糖尿病大鼠糖、脂代謝及氧化應激的影響

張艷萍，崔 鵬，韓淑英，趙 靜，孫瑞軍，江春花，喇孝謹，李繼安*

1河北聯合大學中醫學院，唐山063000 ;2 河北省遷安市中醫醫院，遷安064400;3 河北聯合大學基礎醫學院，唐山063000

糖尿病(diabetes mellitus)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群，除碳水化合物外，尚有蛋白質、脂肪代謝異常，其中2 型糖尿病發病率占DM 發病率90%～95%［1］，其病理生理基礎是胰島素抵抗和胰島β 細胞功能受損，胰島β 細胞功能損傷是糖尿病發生發展的重要因素，干預胰島β 細胞功能受損成為治療2 型糖尿病的新趨勢。我們根據中醫文獻及臨床研究發現，肝腎陰虛是2 型糖尿病主要病機之一［2］，為此擬定了代平顆粒組方，采用高脂喂養聯合小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)尾靜脈注射方法建立2 型糖尿病大鼠模型，觀察其對大鼠糖脂代謝、氧化應激和胰腺組織的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體重(180 ±220)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號:SCXK(京)2006-0009。按每籠5 只喂養，自由飲水和攝食，室溫20～25 ℃，相對濕度(60 ±5)%，12 h/12 h 晝夜規律。

1.2 藥物與試劑

代平顆粒由桑葉、制首烏、桑椹、銀耳組成，于河北聯合大學中醫學院實驗室按設計工藝提取并制成顆粒劑(出膏率27%)。二甲雙胍片(上海中美施寶有限公司);STZ(Sigma 公司)。丙二醛試劑盒，超氧化物歧化酶試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器

AGM－2300 血糖儀(韓國ALL Medicus 有限公司);酶標儀(美國)。

2 方法

2.1 2 型糖尿病大鼠模型建立與分組給藥方法

50 只健康雄性SD 大鼠適應性喂養1 周，隨機分出正常對照組(NC)8 只，喂以基礎飼料，其余42只大鼠喂以高脂飼料(脂肪41%、蛋白17%、碳水化合物42%)，自由進食飲水。4 周后，大鼠禁食12 h，喂高脂飼料組大鼠按25 mg/kg 一次性尾靜脈注射2%STZ 溶液，臨用前用檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液配制。NC 組注射相當劑量的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液。5 d 后大鼠斷尾取血測定空腹血糖(fast blood glucose，FBG)，以FBG≥11.1 mmol/L 為糖尿病大鼠，隨機分成糖尿病模型組(M)、二甲雙胍組(Met)、代平顆粒低劑量組(DL)、代平顆粒高劑量組(DH)。模型成功后次日以灌胃方式給藥，Met 組給藥量為0.14 g/kg·d，DL 組、DH 組給藥量分別為1.5 g/kg·d，6 g /kg·d(生藥)，NC 組和M 組以等量純凈水灌胃，共4 周。

2.2 標本采集

用藥治療4 周后，所有大鼠空腹8 h 后稱重，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，分離血清儲存于-20 ℃;剖腹取胰腺，置于4%多聚甲醛中固定。

2.3 指標檢測方法

2.3.1 空腹血糖檢測

各組大鼠于給藥前、給藥后2 周和4 周，空腹12 h 后斷尾采血，分別用快速血糖測試儀測定血糖。

2.3.2 血脂檢測

甘油三脂(TG)，總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL-C)，高密度脂蛋白(HDL-C)于河北聯合大學附屬醫院檢驗科檢測。

2.3.3 血清SOD、MDA 檢測

用黃嘌呤氧化酶法檢測血清中SOD 活性;用硫代巴比妥酸法(TBA)檢測血清中MDA 含量(參考說明書操作)。

2.4 胰腺組織病理觀察

將胰腺組織取出，常規脫水，石蠟包埋，制成4 μm 切片，經HE 染色后，在光鏡下觀察胰腺組織的病理形態學改變。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠FBG 的影響

與正常組比較，模型組大鼠FBG 水平顯著升高(P ＜0.01)，說明糖尿病模型制備成功;與模型組比較，給藥第2、4 周，二甲雙胍組、代平顆粒高劑量組大鼠FBG 水平顯著降低(P ＜0. 01 或P ＜0.05)，二者比較差異無統計學意義，代平顆粒低劑量組FBG 有下降趨勢，結果表明代平顆粒具有降低FBG 的作用，其降糖作用隨劑量增加而增加(見表1)。

表1 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響(±s，mmol/L)Table 1 Effect of Daiping Granules on FBG of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

表1 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響(±s，mmol/L)Table 1 Effect of Daiping Granules on FBG of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

注:與NC 組比較，* P ＜0.01;與M 組比較，△P ＜0.01。Note:* P ＜0.01，compared with NC group;△P ＜0.01，compared with M group.

Group n 劑量Dose(g/kg·d) 給藥前Before 給藥后After 2 weeks 4 weeks NC 8－6.49 ±0.78 6.00 ±0.94 6.04 ±0.59 M 8－22.49 ±5.67* 22.20 ±5.02* 20.5 ±5.50*Met 8 0.14 23.71 ±5.83* 14.69 ±4.49△ 12.75 ±3.90△DL 8 1.5 22.73 ±6.24* 18.23 ±6.53 16.51 ±4.60 DH 8 6 23.01 ±5.46* 14.30 ±4.42△ 11.21 ±2.95△

3.2 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血脂代謝的影響

與正常組比較，模型組大鼠TG，TC，LDL-C 水平顯著升高(P ＜0.01)，HDL-C 水平顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，二甲雙胍組、代平顆粒高劑量組TG，TC，LDL-C 水平顯著降低(P ＜0.01 或P ＜0.05)，HDL-C 水平顯著升高(P ＜0.01 或P＜0.05)，二者比較差異無統計學意義，提示代平顆粒高劑量組能調節血脂代謝(見表2)。

表2 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血脂的影響(±s，mmol/L)Table 2 Effect of Daiping Granules on serum lipid of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

表2 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血脂的影響(±s，mmol/L)Table 2 Effect of Daiping Granules on serum lipid of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

注:與NC 組比較，* P ＜0.01;與M 組比較，▲P ＜0.01，△P ＜0.05。Note:* P ＜0.01，compared with NC group;▲P ＜0.01，△P ＜0.05，compared with M group.

Group n TG TC LDL-C HDL-C NC 8 0.44 ±0.10 1.40 ±0.26 0.81 ±0.24 0.39 ±0.04 M 8 0.88 ±0.25* 2.02 ±0.42* 1.36 ±0.36* 0.28 ±0.09*Met 8 0.44 ±0.14▲ 1.44 ±0.19▲ 0.85 ±0.21▲ 0.40 ±0.08▲DL 8 0.71 ±0.23 1.74 ±0.35 1.09 ±0.44 0.33 ±0.10 DH 8 0.56 ±0.19▲ 1.56 ±0.29▲ 0.94 ±0.36△ 0.37 ±0.09△

3.3 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血清SOD 活性和MDA 含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中SOD 的活性明顯下降(P ＜0.01)，MDA 含量明顯增加(P ＜0.01);與模型組比較，二甲雙胍組、代平顆粒高劑量組SOD 水平顯著升高(P ＜0.01)，MDA 水平顯著降低(P ＜0.01)，二者比較差異無統計學意義，提示代平顆粒具有一定的抗氧化能力。(見表3)

表3 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血清SOD 和MDA 的影響(±s)Table 3 Effect of Daiping Granules on the levels of SOD and MDA of rats with type 2 diabetes (±s)

表3 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血清SOD 和MDA 的影響(±s)Table 3 Effect of Daiping Granules on the levels of SOD and MDA of rats with type 2 diabetes (±s)

注:與NC 組比較，* P ＜0.01;與M 組比較，▲P ＜0.01。Note:* P ＜0. 01，compared with NC group;▲P ＜0. 01，compared with M group.

Group n SOD(u/mL) MDA(nmol/mL)NC 8 191.19 ±13.81 10.25 ±3.78 M 8 155.78 ±16.42* 19.14 ±5.99*Met 8 183.40 ±12.56▲ 11.00 ±4.27▲DL 8 169.22 ±11.10 15.40 ±6.08 DH 8 183.73 ±12.32▲ 12.22 ±3.43▲

3.4 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠胰腺組織病理形態學的影響

光鏡下觀察正常對照組(圖A):胰島及胰腺腺泡結構完整，胰島數目較多，胰島呈圓形，邊界清晰，胰島細胞排列規整，無腫脹、壞死，無炎性細胞浸潤;糖尿病模型組(圖B):胰島數目較少，胰島明顯萎縮，邊界模糊，胰島細胞排列紊亂，其數量較正常對照組明顯減少，可見細胞腫脹、偶有細胞壞死現象，細胞核可見染色不清或深染;二甲雙胍組(圖C):胰島邊界較清晰，細胞數量較模型組有所增加，核清晰，細胞形態較好，無明顯細胞腫脹、壞死;代平顆粒低劑量組(圖D):與模型組相近，胰島改善程度小，胰島數目較模型組數目有所增加，體積增大;代平顆粒高劑量組(圖E):胰島的結構形態較模型組及低劑量組改善明顯，胰島邊界較清晰，細胞數量較模型組增加，細胞結構完整，無明顯腫脹壞死，無核固縮現象，接近正常胰島結構，而且對胰島的恢復比二甲雙胍顯著。

圖1 各組大鼠胰腺病理形態學變化(HE 染色×200)Fig.1 Pathological morphology changes of pancreas in each group(HE dyed×200)

4 討論

糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，陰虛為本，燥熱為標為其基本病機，陰虛貫穿于糖尿病的始終，涉及肺、脾、腎、肝等臟腑，尤以腎陰虧虛最為重要?！短绞セ莘健访鞔_提出了“三消者，本起腎虛，或食肥美所發也”，黃坤載在《四圣心源·消渴》中云:“消渴者足厥陰之病也。厥陰風木與少陽相火為表里，……凡木之性專欲疏泄，……疏泄不遂，則相火失其蟄藏”，《醫學三字經·消渴》曰“一身中惟肝火最橫，燔灼無忌，耗傷津液，而為消渴”。說明消渴的發生與肝、腎密切相關，腎主水，司開合，為藏精之臟，腎陰虧虛則虛火內灼;腎之開合功能，有賴于肝的疏泄;肝失疏泄，氣郁化火，必先損耗肝陰;肝腎同源，肝火亢盛，下劫腎陰，使腎之陰精耗損，津液不足，則多飲，下焦虛衰，腎氣攝納失職，約束無權，則多尿。故肝腎陰虛，陽熱偏亢是2 型糖尿病主要病機之一。

代平顆粒由制首烏、桑葉、銀耳、桑椹中藥組成，方中制首烏補肝腎，益精血，桑葉清肺潤燥，平抑肝陽，兩藥合用滋腎平肝為該方主藥，銀耳、桑椹潤肺，補腎，生津，全方共奏滋腎平肝，潤肺生津止渴功效?！侗静菰酚涊d何首烏“常食……可輕身”，說明何首烏能調節血脂。我國歷代有桑葉治消渴的記載，《本草綱目》曰“桑葉乃手足陽明之藥，煎汁代茗，能止消渴，名目長發”。唐·《新修本草》記載“桑椹味甘寒、無毒，單食主消渴”。相聰坤等［3］研究何首烏二苯乙烯苷類提取物能明顯降低血清TC，TG，LDL-C，MDA 含量，提高高脂血癥大鼠血清SOD活性。我們進行單味藥篩選實驗發現桑葉有較好的降低空腹血糖和餐后血糖的效果，從桑椹中提取桑椹多糖可以降低2 型糖尿病大鼠血糖，調節血脂［4］。施洪飛等［5］報道黑桑椹提取液使肝臟過氧化脂質(LPO)明顯降低;全血谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)活性顯著提高(P ＜0.01)，認為桑椹提取液具有一定的抗氧化作用。銀耳的藥理活性主要與銀耳多糖有關，前期研究［6］發現銀耳多糖具有明顯降低糖尿病大鼠血糖、血漿HbAIc 含量、增加胰島素分泌，改善胰島素抵抗的作用。綜上所述，該方中藥配伍不僅符合中醫立法原則，而且具有現代藥理學研究依據。

本實驗糖尿病模型組大鼠具有2 型糖尿病大鼠的特征，不僅存在嚴重的糖脂代謝紊亂，表現為FBG，TC，TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C 降低，而且存在氧化損傷，表現為血清MDA 顯著升高，SOD 活力明顯降低，并且有一定程度胰腺損傷。藥物干預后，代平顆粒低劑量組有降糖趨勢，高劑量組能顯著降低2 型糖尿病大鼠的FBG，降低TG，TC 和LDL-C水平，升高HDL-C，SOD 活力顯著升高，MDA 水平顯著下降，說明代平顆粒高劑量組能抑制2 型糖尿病大鼠體內的氧化應激反應;代平顆粒低劑量組胰島改善程度小，與糖尿病模型組相近，高劑量組胰島的結構形態較模型組及低劑量組改善明顯，胰島邊界較清晰，細胞數量較糖尿病模型組增加，細胞結構完整，接近正常胰島結構，而且對胰島的恢復比二甲雙胍組顯著。

本實驗表明代平顆粒高劑量組有效改善2 型糖尿病大鼠糖-脂代謝，其機制可能與抑制體內氧化應激反應，修復鏈脲佐菌素所致的胰島細胞損傷有關。本組方為藥食同源中藥，降糖效應比西藥組相對弱，但可以早期應用和長期應用。

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3 Xiang CK(相聰坤)，Wang R(王蕊)，Yuan ZF(袁志芳).Study on effect of polygonum mutiflorum extract on lipid metabolism and its anti-oxidation in SD rats with hyperlipemia.China Pharm (中國藥業)，2009，24.

4 Tian CY(田春雨)，Bo HM(薄海美)，Li JA(李繼安).Influence of mori fructus polysaccharide on blood glucose and Serum lipoprotein in rats with experimental type 2 diabetes.China Experi Formu (中國實驗方劑學雜志)，2011，17:158-160.

5 Shi HF(施洪飛)，Yang LK(楊立坤)，Cao H(曹暉)，et al.Effect of black mulberry extract on mouse lipid peroxide content.Henan TCM (河南中醫藥學刊)，2001，16(2):24-25.

6 Bo HM(薄海美)，Tian CY(田春雨)，Li JA(李繼安).Effect of tremella polysaccharide on experimental type 2 diabetic rats with insulin resistance.Shizhen Med Res (時珍國醫國藥)，2011，22:1926-1927.

7 Subhrojit Sen，Moumita Roy，Abhay Sankar Chakraborti.Ameliorative effects of glycyrrhizinon streptozotocin-induced diabetes in rats.Pharmacy and Pharmacology，2011，63:287-296.